Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel Anti-Flag亲和纯化凝胶

产品描述

Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel）由高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体与Sepharose 4B gel通过供价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1 mg protein/mL凝胶），杂蛋白非特异结合少，可用于带有Flag标签的融合蛋白免疫沉淀（IP）和纯化。

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶）可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。未开封的产品在-20℃下可稳定保存1年。禁止在不含甘油的溶液中冻存！

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 本产品仅作科研用途！

使用方法

一、制备细胞裂解液（以哺乳动物细胞为例）

注意：样品中不能含有颗粒不溶物，可以用0.22 μm滤膜过滤或10,000×g离心15 min；如有必要，可以加入蛋白酶抑制剂；如样品太粘稠，可以加入核酸酶处理。

细胞密度70-90%，100 mm培养皿（约10⁶-10⁷细胞），加入1mL裂解液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100）。推荐加入蛋白酶抑制剂Cocktail（Cat 20123ES）。

1）清洗细胞

贴壁细胞：去除生长培养基，用PBS洗2次，去除PBS，加入裂解液（10⁶-10⁷ cells/mL）。

     悬浮细胞：细胞转移到离心管中，420×g离心5 min，去除上清。用PBS重悬，420×g离心5 min，重复1次，去除上清，

加入裂解液重悬（10⁶-10⁷ cells/mL）。

2）加入裂解液后，孵育15-30 min。

3）离心，12,000×g，10 min。【贴壁细胞离心前先把细胞刮下来】

4）收集上清到预冷的样品管中。上清可储存在-70℃。

二、应用

可以使用层析柱或免疫沉淀（IP）纯化目的蛋白。1-3 mL凝胶层析柱可以纯化约100 mL细胞裂解液；如样品体积较小（1-2 mL细胞裂解液），可以使用免疫沉淀（IP）法；如需处理较大体积细胞裂解液，推荐使用溶液体系。

1 层析柱法

1.1 装柱

1）准备层析空柱（Cat 20520ES-20526ES）；用2-3倍柱体积的TBS（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）或其他适合缓冲液洗柱2次。

2）颠倒混匀Anti-Flag亲和纯化凝胶，保证凝胶均一。取1-3 mL凝胶装柱（纯化约100 mL细胞裂解液）。

3）用2-3倍柱体积的TBS洗2次，待液体流尽后，用3倍体积的0.1 M Gly-HCl，pH 3.5冲洗，要保证凝胶平面平整。Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20 min。

4）用5倍体积TBS平衡凝胶柱，直至流出液达到中性pH。

1.2 纯化

1）上样：在层析柱中加满蛋白裂解液，重复上样2-3次可以尽可能增加蛋白与凝胶结合量。

2）清洗：用10-20倍柱体积的TBS清洗，以去除非特异结合的蛋白。

3）洗脱（可选以下2种方法之一）：

A、酸洗脱：收集管中加入15-25 μL 1 M Tris，pH 8.0，分别用1 mL 0.1 M Gly-HCl，pH 3.5洗脱，再重复5次。

B、3×Flag多肽（Cat 20571ES）洗脱：用TBS配制Flag多肽溶液（100 μg/mL）洗脱，分别用1倍柱体积多肽溶液洗脱，重复4次。

1.3 填料再生与保存

1）柱再生：使用后立即再生，用3倍柱体积0.1 M Gly-HCl，pH3.5清洗，立即用TBS平衡，直至达到中性pH.

2）保存：用10倍柱体积TBS（含50%甘油，0.02%叠氮钠）清洗，再加入5 mL该溶液至柱中，保存在2-8℃或-20℃中。

2 免疫沉淀（IP）

2.1 免疫沉淀（IP）

1）充分重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶，尽量形成均一的溶液。取40 μL混合液（20 μL gel）至新的离心管中。

2）5,000-8,200×g离心30 s，使凝胶沉淀在离心管底部，在加入样品前，静置1-2 min。去除上清，此时要小心操作，避免吸到凝胶。

3）加入500 μL TBS，轻轻的重悬Anti-Flag Affinity Gel，10,000 rpm离心30 s，弃上清，重复上述步骤1次。

4）可选步骤。为去除凝胶中痕量的未结合抗体，可加入500 μL 0.1 M glycine HCl，pH 3.5清洗凝胶，离心去除上清，加入3倍体积TBS，轻摇2-3分钟，5,000-8,200×g离心30 s，弃上清，重复洗涤至上清pH为中性。Glycine HCl处理时间切勿超过20 min。

5）加入200-1000 μL细胞裂解液，如有必要，可用裂解液调整至终体积1 mL。细胞裂解液的体积取决于Flag融合蛋白的表达量。阳性对照，需要加入1 mL TBS和4 μL 50 ng/μL Flag-BAP融合蛋白（约200 ng）；阴性对照，只要加入1 mL裂解缓冲液即可（不含蛋白）。

6）4℃缓慢孵育2小时。如需提高结合效率，可延长至过夜。

7）5,000-8,200×g离心30 s，去除上清。

8）上述沉淀用0.5 mL TBS，轻摇混匀，5,000-8,200×g离心30 s去尽上清，重复3次。

2.2 Flag融合蛋白洗脱（可选以下3种方法之一）

1）非变性洗脱（3×Flag多肽）

a. 配制3×Flag多肽洗脱液：用0.5 M Tris-HCl溶液，pH 7.5（含1M NaCl）溶解3×Flag多肽，终浓度为25 μg/μL。用ddH₂O稀释至5 μg/μL，加入3 μL 5 μg/μL的3×Flag多肽，加入到100 μL TBS中（终浓度150 ng/μL）。