Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit( flow cytometry) 线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒(流式分析)

取出试剂并回温至室温，吸取50 µLDMSO溶解1管Calcein AM，混匀后避光保存。

【注】：钙黄绿素一旦溶解后，建议设置一系列实验将其短时间内用完，不能长期保存钙黄绿素溶液。

2、 细胞染色（流式分析）

1）用本试剂盒含有的Cell Stain Buffer将细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×10⁶细胞/mL。

【注】：① 用于离子霉素对照样品的缓冲液必须含有Ca²⁺；

       ② 钙黄绿素加载时不能含有血清；

       ③ 细胞必须为单细胞悬液。

2）按照1ml每管将细胞悬液等分，每个样品等分成3份。

后续染色顺序：1号管仅含钙黄绿素，2号管含钙黄绿素和CoCl₂，3号管含钙黄绿素，CoCl₂和离子霉素，另外准备一管不含试剂的细胞样品用于相应的仪器设置。

3）用Cell Stain Buffer 1:500稀释1 mM Calcein AM储存液，制备成2 µM的工作液，例如取5 µL 1mM储存液加入2.5 mL Cell Stain Buffer，混匀即可。

4）向上述每个样品的3管中分别加入5 µLCalcein AM工作液并混匀。

5）向2号、3号管中加入5µl CoCl₂，并混匀。

6）向3号管中加入5 µLIonomycin(100µM)，并混匀。

7）在37℃避光孵育15 min。

8）向每管中加入3.5 mLCell Stain Buffer，离心收集细胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起荧光淬灭的试剂。

9）用400 µL同时可用于流式检测的合适的缓冲液重悬细胞团。

如果需要，也可进行进一步染色。如用标记的Annexin V 检测磷酯酰丝氨酸易位；用PI 检测细胞活力；或者用MitoTracker红色探针检测线粒体活力等。注意整个过程均需避光操作。

10）染色后，将样品置于冰上，1 h内进行流式分析。

11）用不含试剂的细胞样品进行相应的仪器设置。用流式488激发器进行荧光分析，Calcein AM最大激发波长494 nm，最大发射波长517 nm。

1号管-仅含钙黄绿素：线粒体和胞浆有荧光，荧光信号较强；

2号管-含钙黄绿素和CoCl₂：仅线粒体呈现荧光，荧光强度居中；

3号管-含钙黄绿素，CoCl₂和离子霉素：线粒体和胞浆荧光均被淬灭，荧光信号最弱。

2号管和3号管荧光信号的变化说明线粒体通透性转换孔被不断的激活。

HB230308