外周血单个核细胞（PBMC）分离试剂盒（密度梯度离心）

产品名称	外周血单个核细胞（PBMC）分离试剂盒（密度梯度离心）
货号	SNE-001
规格	125mL/500mL
产品简介	本产品是一种无菌、无内毒素、无热源的等渗溶液，其主要成分是聚蔗糖（Ficoll）和泛影酸钠（Sodium Diatrizoate），密度为1.077±0.001 g/mL。该密度恰好介于外周血中单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC，主要包括淋巴细胞和单核细胞）与粒细胞、红细胞之间。通过密度梯度离心，可以快速、有效地从外周血（已验证人/大鼠/小鼠）中分离出高纯度、高活性的PBMC。
使用方法	一、实验准备材料： 1.器材： 无菌肝素钠或EDTA抗凝采血管 无菌离心管（15 mL或50 mL锥底离心管） 移液器及无菌吸头 水平转子离心机 生物安全柜/超净工作台 PBS缓冲液（含1-2%胎牛血清FBS可减少细胞粘附） 细胞完全培养液（如尚恩生物SNPM-H287人外周血单个核细胞完全培养基/SNPM-M102小鼠外周血单个核细胞完全培养基/SNPM-R102大鼠外周血单个核细胞完全培养基） 2.样本： 外周血，使用肝素钠或EDTA进行抗凝处理。 建议使用新鲜血液，或采集后4小时内尽快进行分离。 二、操作步骤： 核心原则：始终保持分离液与血液样本的分层界面清晰。 1.稀释血液： 将采集的抗凝全血与等体积的样品稀释液轻轻混匀，进行稀释。（注：稀释可降低血液密度和粘度，提高分离效率） 2.铺层： 1）取一个无菌离心管，先加入适量的外周血细胞分离液（例如，对于2 mL稀释血加入3 mL分离液；4毫升稀释血加5 mL分离液）。 2）用移液器吸取稀释后的血液，将吸头尖端伸至分离液液面上方，沿着管壁缓慢、匀速地加在分离液液面上。最终形成清晰的上层（稀释血）、下层（分离液）结构。（注：动作务必轻柔，避免冲击界面，使两层液体混合。） 3.密度梯度离心： 1）将离心管对称放入水平转子中，配平。 2）设置离心条件：室温，450 g（或约1500-2000 rpm），升速降至最低，降速设为0，离心30分钟。（注意：离心机品牌和转子型号不同，g力会有差异。若无“升速/降速”设置，请手动选择最慢的加速和刹车档位。不同体积的血液样本离心时间和转速会有差异，体积越大离心转速和时间会更多，需要自行摸索最佳离心方案以达到最佳分离效果） 4.收集PBMC： 1）离心后，小心取出离心管，管内液体分为四层（如图所示）： 2）用移液器小心地吸掉最上层的血浆层，直至接近白膜层。 3）用新的1毫升无菌枪头，轻轻沿离心管壁旋转，将白膜层细胞全部吸取至一个新的无菌离心管中。（注意：尽量少吸取分离液，以免污染。） 5.洗涤细胞： 1)向含有PBMC的离心管中加入5-8倍体积的PBS缓冲液（或含血清的培养液），轻轻吹打混匀。 2)进行离心，离心条件：室温，450 g（约1500 rpm），离心10分钟。 3)离心后，弃去上清液，可见管底白色细胞沉淀。 4)重复洗涤1次，以确保去除残留的分离液。 5)再次加入PBS缓冲液（或含血清的培养液）清洗，200g，离心5分钟，尽量去除残留血小板。 6.细胞计数与培养： 1）用适量的完全培养液或后续实验所需的缓冲液重悬细胞。 2）取少量细胞悬液，使用台盼蓝染色法进行细胞计数和活力测定。 三、预期结果： 细胞得率：通常，一只健康成年小鼠可采集到0.8-1.2 mL全血，分离后可获得约1-5×10^6个PBMC（得率因小鼠品系、年龄和健康状况而异）。 细胞活力：使用本方法分离的PBMC，其活力通常高于95%。 细胞纯度：PBMC中淋巴细胞占比最高（约80-90%），单核细胞次之（约10-20%）。
产品组分
存储条件	18-25°C 室温条件下避光储存。请勿冷冻，冷冻会破坏其结构导致失效。
保质期	两年
常见问题

注意事项：
1.无菌操作： 整个分离过程应在无菌环境下进行，以防细胞污染。
2.温度： 所有试剂和离心均应在室温（18-25°C） 下进行，低温会影响分离液密度和细胞回收率。
3.轻柔操作： 在铺层、吸取细胞层和洗涤过程中，动作务必轻柔，避免物理剪切力对细胞造成损伤。
4.血液新鲜度： 使用新鲜血液是获得高活力细胞的关键。陈旧血液会导致细胞死亡和分层不清。
5.离心机设置： 正确的离心速度和时间至关重要。过高的速度会导致粒细胞污染，过低则回收不全。关闭刹车（或设为最低） 是保持分层界面清晰的关键。
6.红细胞去除： 如果得到的PBMC中红细胞残留较多，可使用红细胞裂解液（例如尚恩生物SNR-007 红细胞裂解液(10x，不含固定剂)）进行处理。