Ni SEPHAROSE 6 Fast Flow, 25 mL|亲和层析标签蛋白纯化填料|蛋白纯化凝胶|cytiva

Ni Sepharose 6 Fast Flow是一种高结合量的IMAC层析填料，用于纯化组氨酸标签的蛋白质。在各种规模中用于纯化的良好选择。

这是一款最常规的填料，有着高载量，良好的兼容性、流速快、易放大等特点，是组氨酸标签手动纯化的常规选择，是一款经济实惠的入门基本款

一方面 若His标签蛋白没有结合到填料上就流穿了

原因1 超声的功率不对

超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。

建议：改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。

原因2 结合缓冲液条件不合适

建议：检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螯合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。pH的改变也会对结合效果有影响，可以摸索不同的pH条件，可能会收到意想不到的效果。

原因3 His标签没有表达或丢失或暴露不充分

建议1：用anti-His的抗体进行WB，检测His标签是否存在。

建议2：将蛋白用4-6M盐酸胍或4-8M尿素变性后，让His标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。

建议3：改变His标签的位置或者增加其数目（常用6-10个His），增加暴露和结合机会。

建议4：改变金属结合离子，除了Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用来进行His标签的捕获。

另一方面 若His标签蛋白结合了，但是洗脱不充分

原因1 洗脱条件太温和

建议：增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱，或者通过降低pH寻找最佳洗脱条件。需要注意的是，pH低于3.5容易导致镍离子脱落。

原因2 蛋白柱上沉淀

建议1：降低蛋白浓度。可以减少上样量，或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱，增加蛋白稀释度。

建议2：使用去污剂或者改变NaCl的浓度，或者使用变性剂（4-6M盐酸胍或4-8M尿素）在变性条件下洗脱。

原因3 非特异性的疏水或者其他相互作用

建议：加入非离子型去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的浓度洗脱。