CMCC(B)63501

微生物检测冻干质控菌种使用说明书

1、复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护及无菌条件下进行。

2、启开菌种前，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。在无菌条件下，打开西林瓶，加入0.3mL左右的配套液体培养基，用无菌滴管反复吹吸，将冻干菌种溶解成为悬液，然后用无菌滴管或接种环移至斜面、平板或液体培养基，并连同剩余菌悬液的西林瓶一起放置于36℃培养箱中进行培养。

3、次日观察菌种的生长情况，如未生长，应继续培养24h，或吸取培养之后的西林瓶剩余菌悬液再次接种培养基，培养24h观察。4菌株为一次性使用品，开启之后不能反复使用或保存，暂不开启的菌种应在4℃保藏。5复苏后的菌种在传1-2代后使用，建议菌种使用5代后弃用。

培养基、培养条件和保存方法

方法1：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂（022020）斜面上35－37℃划线培养24－48h。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法2：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂（022020）斜面上划线35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法3：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于血平板（024070）后涂布，35－37℃培养24－48h。平板（第一代）放于4℃冰箱保存，并用封口膜或其它封条密封平板，每半个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法4：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（026020）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法5：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于疱肉牛肉粒肉汤（027140）加液体石蜡1cm,35－37℃培养48－72h。肉汤（第一代）放于4℃冰箱环境下保存，每半个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法6：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入碱性蛋白胨水，充分悬浮后取适量的菌悬液于碱性琼脂（025040）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法7：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入3％NaCl碱性蛋白胨水，充分悬浮后放置于36℃下复苏8-12小时。取适量的菌悬液于3％NaCl营养琼脂（营养琼脂（022020）加入2.5gNaCl/100mL）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法8：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入沙氏液体培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（021050）斜面25－28℃培养2－5天。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每两个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法9：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入布氏肉汤，充分悬浮后取适量的菌悬液于血平板（024070）42±1℃微需氧条件下培养48－72h。平板（第一代）放于4℃冰箱微需氧环境下保存，并用封口膜或其它封条密封平板，每个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法10：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入TPY肉汤，充分悬浮后取适量的菌悬液于BBL琼脂（027330）斜面厌氧环境下35－37℃培养48h－72h。斜面（第一代）放于4℃冰箱厌氧环境下保存，每个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法11：无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干粉中加入脱脂奶粉溶液，充分悬浮后取适量的菌悬液于脱脂奶粉溶液（10%）35－37℃培养48h-72h。菌种（第一代）放于4℃冰箱保存，每两个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应消毁。