组织空间原位多组学分析系统

一、概述-- Xenium组织空间原位多组学分析系统

这是一台高度自动化、高通量的组织原位分析技术平台，帮助用户实现亚细胞分辨率的靶向基因和蛋白表达原位分析。它在10x Genomics早期收购的ReadCoor和Cartana的基础技术之上做了大量研发和改进。Xenium将单分子RNA和蛋白检测的功能与强大的光学元件、数据采集和解码技术相结合，能够以亚细胞分辨率在整张切片上快速检测大量靶点的组织原位表达水平。该平台可以兼容多种样品类型，包括新鲜冷冻（FF）组织和福.尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。Xenium平台拥有一条不断拓展的产品路线图，不断增强核心平台的分析能力和分析物种类，比如一张切片同时检测RNA和蛋白质表达水平。品牌10x Genomics，型号Xenium In Situ，产地新加坡，代理商是斑马鱼（北京）科技有限公司，从组织制备到数据分析，该平台将会得到技术专家团队的全方位支持。

二、平台概览 The Xenium In Situ platform

有了Chromium和Visium等分析，研究人员能够分别检测单个细胞或整张组织切片的全转录组。在后续研究中，他们可以采用靶向原位分析技术，这不仅能够在组织细胞生物学状态下对细胞进行定位和分型，还能够针对先前从Chromium和Visium数据中获得的信息来详细研究各种具体问题。

Xenium平台可帮助科学家展示、定量和分析固定在载玻片上的FF和FFPE组织切片中的基因表达和蛋白丰度。还将提供一系列针对不同组织类型和应用场景的试剂菜单选项，以及添加客户定制靶点的选项，从而实现对目标靶点进行高灵敏度的原位分析。

这是一个端对端的完整解决方案，包含一台强大的可实现高通量分析的全自动仪器，提供机载分析功能，可处理图像数据，定位RNA和蛋白信号，并开展二级分析。您也可以轻松地传输数据，使用10x Genomics提供的软件或您选择的第三方软件工具进行分析可视化。

三、工作流程概览

Xenium工作流程从在Xenium载玻片上制备组织切片开始（图1）。对切片进行处理以暴露出易于杂交的RNA和蛋白质分子，并分别用可环化的DNA探针和带有DNA标签序列的抗体进行杂交标记。DNA探针的两侧带有两个目标RNA特异性的独立杂交的区域。它们还包含基因特异性的标签序列。每对探针末端在与目标RNA区域杂交后会连接产生可酶促扩增的环状DNA探针。这种连接设计确保了每对探针与目标RNA区域杂交的高特异性。蛋白质检测将是该平台未来将拓展的一项功能，它将采用荧光探针杂交标记蛋白的DNA条码序列来检测组织切片中每种标记蛋白的表达水平。

每次实验中，可将最多两张载玻片放入Xenium分析仪内。结合在RNA上的扩增后的DNA环状探针与荧光标记的已知短序列探针结合，产生明亮、易于成像且信噪比高的信号。样本经过连续几轮的荧光探针杂交、成像和去除。接着生成每个基因特异性的荧光特征条码，从而实现目标基因的定位和识别。通过荧光探针与抗体上DNA标签序列的杂交可进一步检测蛋白质，并构建出整张组织切片上转录本和蛋白质的全景空间表达图谱。然后，通过细胞核染色，确定细胞核膜位置、形态来推断细胞边界，或通过细胞形态染色来确定细胞边界。最后将细胞边界信息映射到RNA和蛋白表达图像上，并将转录本和蛋白质根据位置坐标分配给每个细胞。

四、Xenium平台

1.样本制备

Xenium工作流程与FF组织和FFPE组织都兼容，首先是在Xenium载玻片制备所需组织的切片。这些切片经过脱蜡和透化等处理，让RNA和蛋白分析物暴露出来。RNA与可环化的DNA探针杂交结合，该探针包含两个与目标RNA特异性杂交的区域以及另一个基因特异性标签序列区域。探针的两端与目标RNA杂交结合，通过连接两端后产生环状DNA探针。如果探针发生非特异杂交或脱靶，则不会发生连接反应，从而抑.制非特异性信号并确保高特异性。未来的蛋白检测功能将采用荧光探针杂交标记抗体的DNA标签序列来检测组织切片中每种被标记蛋白的表达水平。DNA探针连接后，环化探针经过酶促扩增，生成每个RNA杂交事件的基因特异性标签序列的多个拷贝。这会产生更强的信号，易于成像分析且信噪比高，这在分析自发荧光背景高的样本（如FFPE组织）时尤其重要。

2. Xenium分析仪上的解码流程

Xenium分析仪（图2）是全自动的，带有数据并行处理功能，可快速输出数据，帮助用户及时进行数据分析解读。仪器内置成像系统使用高数值孔径(NA)以及带有低噪声传感器的快速区域扫描照相机，可实现约200 nm的像素分辨率。它的视场为600 x 900 μm，Z轴多层光切图像是在整个组织厚度上以0.75 μm的步长逐一获得的。FFPE组织切片的常见厚度通常为5μm，而FF组织切片厚度为10 μm。采集的图像可通过Xenium分析软件进行处理，以实现sub-50 nm定位分辨率的单分子水平检测。此外，该仪器还集成了样本处理、液路和宽场荧光显微镜成像系统。Xenium分析仪一次运行最多可上样两块载玻片，每块玻片的可成像分析区域面积约为12 x 24 mm。这样大小的成像分析面积让科学家能够灵活地在每块载玻片上放置多张切片和多个样本。分析物检测和图像采集分析是在Xenium分析仪上按逐个循环进行的。试剂耗材（包括检测RNA和蛋白质分子的荧光标记探针）在仪器内全自动运行每个循环、孵育、成像和移除。

在荧光标记的探针与扩增后的基因特异性标签序列结合后，样本会经历连续几轮的荧光探针杂交、成像和探针移除。对于分析物检测，在此过程的每个循环中，每个标签序列，也就是每个RNA的标记，都以特定的颜色打开或关闭。这会产生每个基因特异性的荧光特征条码。在读取这个打开或关闭的荧光特征条码后，软件可解码出所有目标基因的身份。在仪器结束运行时，系统对数据进行分析整合，并构建整张组织切片上转录本的空间图谱。成像系统使用高数值孔径以及带有低噪声传感器的快速区域扫描照相机，实现高灵敏度和高分辨率的原位分析。

3. 基因和蛋白靶向试剂

Xenium平台使用靶向试剂组合在亚细胞分辨率水平检测组织原位基因和蛋白表达量。使用组织和应用特异性基因组合，并支持额外客户定制基因选项，将是解决不同类型样本中基因和蛋白表达多样性和差异性的最.好策略。商业基因组合试剂是经过大量数据挖掘甄选后构建的，综合了全面的单细胞图谱研究结果以及各个研究领域专家的人工审核和宝贵建议。

基因组合

10x Genomics正在针对某些组织和应用开发商业试剂的基因组合菜单。这些模块化的组合可分开或组合使用，可以更好的支持各个项目的个性化需求。每个Xenium基因组合预计包含几百个基因，并且可针对每个项目进行定制，目前计划最多可添加50个客户定制基因。商业试剂组合定制基因组合的最初的最.大多重检测能力为400个基因。Xenium平台本身是为1,000个基因的多重检测能力而开发的。未来的产品扩展将让Xenium基因组合适用于更多物种、组织和研究应用方向。最终也将有望根据研究人员的需求提供更多客户定制功能。

蛋白质组合

未来的产品线扩展将增加蛋白质组合，作为Xenium产品线的一部分。

4. 软件系统——数据管理和分析

Xenium平台包含机载分析功能，能够处理图像数据，定位分析物信号，并开展二级分析，以便将分析的靶点表达信息分配给不同细胞，生成分析物表达谱——细胞矩阵。二级分析使用细胞核和细胞形态信息来鉴定组织切片上的细胞边界。机载分析与仪器运行并行开展，实现最短运转周期。Xenium整体解决方案还将包含基因组合探针设计工具，以便完成上游实验设计和个性化实验定制功能。

Xenium解决方案还包含了用于下游分析的数据分析管线和可视化工具，让科学家能够探索和挖掘Xenium数据。这将帮助科学家能够快速获取可分析、解释的组织原位分析数据。Xenium分析仪产生的数据可轻松从仪器中下载、转移出来，并与对应的组织形态和细胞边界等信息结合分析，通过10x Genomics提供的软件进行可视化和进一步分析。此外，数据还可以开放的标准文件格式输出，便于研究人员使用第三方软件和专业研究者开发的高阶工具进行数据分析。

5. 技术培训和支持

10x产品包括Xenium、Visium CytAssist、Chromium Controller，Chromium X、Chromium™ Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit、Visium Spatial for FFPE Gene Expression Kit、Chip G、Feature Barcode Library Kit……斑马鱼（北京）科技有限公司是10x Genomics代理商，负责销售仪器和试剂，具备丰富的单细胞测序和空间转录组实验方面经验，可为用户提供单细胞悬液制备，建库，测序，生信分析等一整套解决方案。在购买Xenium分析仪后，将安排有资质的工程师进行现场安装和培训。培训内容包括样本制备、仪器操作、数据分析。在培训完成后，客户还将获得全方位支持，包括远程技术支持（Technical Support）、现场应用科学家（FAS）、现场服务工程师（FSE）和生物信息学应用（Applied Bioinformatics）团队，覆盖实验工作流程、试剂耗材、仪器和软件的各个方面。

6. 基础技术

Xenium技术建立在收购ReadCoor和Cartana公司而获得的专利技术基础之上，这两家公司分别由George Church和Mats Nilsson实验室开发并商业化而来，Xenium技术同时融合了10x Genomics自主开发的专利技术。综合以上各种基础技术产生的10x Genomics专有的原位分析技术在灵敏度、特异性和样品通量方面都比原来基础技术提高了数倍。

五、代表性的数据

以下这些数据集，是使用Xenium分析仪和200基因的人类乳腺癌基因组合从FFPE包埋的人类浸润性乳腺癌组织切片上生成的，并与同一组织块的苏木精和伊红（H&E）染色切片进行比较，H&E染色切片之前由病理学家进行了切片注释，并通过Visium FFPE技术进行了检测和分析。

1. Xenium数据

使用包含200个基因组合试剂对人类浸润性乳腺癌FFPE组织进行分析。分析后生成了一幅转录本的空间图谱，每个RNA转录本带有x、y和z坐标。通过DAPI染色确定细胞核边界，并通过扩展细胞核边缘来估算细胞边界（图3）。所有RNA转录本被分配到特定细胞中，并生成gene-by-cell矩阵。根据每个细胞的RNA含量和基因组合中的标志物识别细胞类型。例如，ERBB2可用来鉴定肿瘤细胞，而编码核心蛋白聚糖的DCN可用来鉴定基质细胞。淋巴细胞和巨噬细胞可通过特定CD标志物来鉴定。按照分配的细胞类型对不同细胞进行不同色彩标识。这就产生了按细胞类型来区分的细胞空间表达图谱，每个细胞内有分配到该细胞的全部靶向RNA转录本。

2. 关联数据比较

来自同一乳腺癌FFPE组织块切片的H&E染色结果显示出独特的肿瘤特征。病理学家对该FFPE切片的注释，确定了浸润肿瘤被各种纤维组织、脂肪组织和肿瘤坏死区域环绕。Xenium数据与病理学家注释的浸润癌的特征具有很好的相关性（图4）。

接着使用Visium FFPE空间基因表达分析对同一组织切片进行处理，以便将通过Visium数据观察到的空间表达图谱分布与通过Xenium获得的原位表达图谱进行比较。我们发现，使用Visium数据（通过NGS测序得到的数据）和Xenium数据（通过显微镜以亚细胞分辨率检测得到的数据）观察到的基因空间分布之间存在很强的相关性（图4）。

综上，这些数据表明，Xenium平台可以很好地重现病理学家注释的H&E染色图像的细胞分型和病理区域注释，并可以高分辨率验证使用Visium平台观察到的基因表达空间分布。

六、主要应用场景

使用Xenium组织空间原位多组学分析系统，研究人员能够通过亚细胞分辨率的多重RNA和蛋白质表达检测加深对健康和病变组织的了解。主要应用在以下方面：

• 绘制阿尔茨海默病的细胞类型图谱(1)

• 根据多种细胞类型的多个标志物基因对组织切片进行空间原位解析(2,3)

• 对复杂发育过程及背后的细胞转录状态进行时空组学原位解析(4)

• 对单细胞测序数据进行组织切片原位验证，原位分析结果可以加深对组织亚结构分子基础的进一步了解(5)

以上文献中的数据仅代表原位技术的一般应用，不代表10x Genomics Xenium平台的灵敏度和分辨率。自从收购了Cartana和ReadCoor两家原位测序技术公司以来，10x Genomics投入大量人力物力对上述范例中描述的原位技术进行持续的开发和改进。Xenium分析仪将以上两种基础原位测序技术与10x Genomics专有改进方案相结合，提供了一个分辨率和灵敏度比上述已发表数据更高的全新平台。Xenium还显著改进了原位分析技术的易用性和数据生成时间。

七、使用Xenium平台开展原位分析研究的理由

Xenium组织空间原位多组学分析系统具有许多技术优势，已成为以亚细胞分辨率分析多重空间基因表达和蛋白质表达的理想产品。该平台的核心是全自动和高通量的Xenium分析仪，可以自动进行探针标记、成像和机载数据分析等全流程功能。

• 强大而灵活的核心平台——Xenium是一个强大而灵活的核心平台，适用于各种组织、样本类型和应用。此外，该平台的设计理念是未来可不断增添新功能，包括额外的组织特异性和疾病特异性的基因组合、同一切片上RNA和蛋白质的同时检测，以及同时检测1,000种分析物的多重分析能力。

• 起始样本的灵活性——Xenium技术流程可以兼容新鲜冷冻组织（FF）和福.尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）样品。

• 多重分析和亚细胞分辨率——Xenium平台能够以亚细胞分辨率检测多达400个RNA转录本（初上市时），并有望在未来实现多达1,000个分析物的同时检测。

• 具有定制功能的人工审核基因组合——Xenium平台可使用商业试剂的基因组合，这些基因组合是经过大量数据挖掘甄选后构建的，综合了全面的单细胞图谱研究结果以及各个研究领域专家的人工审核和宝贵建议。Xenium基因组合能够增加定制基因集合，这些基因组合在交付后可立即用于Xenium分析。此外，10x Genomics还致力于不断扩展商业试剂供应的Xenium基因组合菜单种类，逐步会包含更多的组织和应用类型。

• 轻松易用的流程——Xenium平台是一个轻松易用的完整解决方案，包含制备样本所需的试剂和Xenium分析仪上配合图像采集需要的试剂，以及用于后续数据分析、可视化和数据解读的10x Genomics软件。

• 超大通量——Xenium分析仪可在成像区域内开展超高重靶点组织全景分析。每块Xenium载玻片上有一个大的可成像区域（12 x 24 mm），单次运行可同时加载和分析两张切片。单次样品通量由可成像区域内包含的组织切片数量决定。例如，如果组织切片的大小为10 mm x 10 mm，则每块载玻片可容纳两张切片，并且单次运行可同时分析四张切片。仪器运行大约需要两天的时间，每周通量为12张组织切片/周，以此类推，分析样品组织切片越小，单周内可分析的样品数目会显著增加。

• 全面的数据分析解决方案——10x Genomics提供数据分析流程用于数据分析和再分析，并提供先进的软件用于数据可视化分析。Xenium分析仪产生的数据可轻松从仪器中转移出来，并与基本组织形态、细胞边界信息等结合用于可视化分析。10x Genomics提供的软件支持进一步高阶分析。数据以行业标准的文件格式提供，让科学家可自由使用他们选择的各类分析工具。

• 细胞类型分配——10x Genomics软件将每个检测到的转录本或蛋白质分配给单个细胞，让科学家能够根据他们选择的基因组合对细胞类型进行分子水平注释。

• 全面专业的支持资源——10x Genomics提供全面的支持资源，既包括我们的技术支持科学家、现场应用科学家、现场服务工程师和生物信息学应用科学家，他们都接受过Xenium流程、仪器和分析的专业培训，也包括免费提供的视频和技术文档，这些可帮助指导新用户顺利完成Xenium实验流程。

• 产品质量认证——10x Genomics的产品开发和制造流程已通过ISO 9001:2015认证。

八、斑马鱼（北京）科技有限公司，是10x Genomics公司的官方授权经销商，负责产品的推广销售和技术支持，为您提供技术参数，报价、选型、实验指导、安装培训、售后服务等，更多信息可留言或来电咨询。

​