上海同科分子生物试剂无内毒素质粒小量提取试剂盒

产品名称：无内毒素质粒小量提取试剂盒

英文名称：Endo-Free plasmid mini kit

包装规格：

有效期：本产品在常温(15-25℃) 干燥条件下可保存12个月。

产品原理和特点：

无内毒素质粒小量提取试剂盒使用无胍盐质粒纯化方法，最高可以获得高纯度的质粒50 μg，操作方便；过滤柱除去内毒素，使内毒素浓度<0.1 EU/µg；没有盐离子残留，提高测序、连接、转化和酶反应效率。

使用前准备事项：

1、使用本产品前，请务必仔细阅读说明书；

2、EFW(70%乙醇)在首次使用前加入42 mL无水乙醇，混匀后使用；

3、Buffer RA在首次使用前加入RNase A，2-8℃保存。

4、检查Buffer RB 有无沉淀。如有混浊现象，可在37 ℃水浴中加热至澄清；

5、全部操作均在室温进行，低温离心不利于酶去除 RNA；

6、从步骤“10”起，使用新的无内毒素的枪头转移液体并小心操作，可避免引入新的内毒素污染物。

操作步骤：

1、取大肠杆菌过夜培养液 1~4 mL，12,000 rpm室温离心 1 min，弃上清收集菌体。

2、向菌体中加入溶液 RA 200 µL，涡旋振荡，充分混悬菌体。

*不要残留菌块，会影响质粒得率和纯度。

3、加入溶液 RB 200 µL，立即温和上下颠倒5-7次，使之充分混匀，室温静置3 min，形成透明溶液。

*不操作不可剧烈，以免震断细菌基因组DNA；也不可超过5 min，以免破坏质粒完整性。

4、加入溶液 RC 200 µL，立即温和地上下颠倒 5~7 次，使之充分混匀。加入100 µL无水乙醇，颠倒混匀。12,000 rpm室温离心10 min。

5、将上清全部转移至套有过滤柱的结合柱中。12,000 rpm 室温离心 2 min，弃滤液。

6、将结合柱放回，向结合柱内加650 μL 80%乙醇（自备），12,000 rpm室温离心1 min，弃滤液。

7、将结合柱放回，12,000 rpm室温离2 min，除去结合柱内残留液体。

8、将结合柱放入新的1.5mL离心管中，敞口室温放置5~10 min 使乙醇充分挥发。

*残留乙醇将严重影响 DNA 洗脱。

9、向结合中加200 μL Elution Buffer，室温静置2~3 min，12,000 rpm室温离心1 min，弃掉结合柱。

*将Elution Buffer预热至60 ℃左右，可以增加洗脱效率。

10、向洗脱液中加入Buffer RE 200  μL，颠倒混匀，室温静置5 min。

11、加入Buffer NE 140 μL，颠倒混匀，并移入Endo-free过滤柱中，静置5~10 min。12,000 rpm室温离心2 min，弃过滤柱。

*静置5~10 min可使絮状物分层，利于过滤。弃过滤柱前，确认无液体残留，否则再次离心过滤。

12、向滤液中加入等体积的异丙醇（或者两倍体积的无水乙醇，自备），颠倒混匀后室温放置15 min，10,000 rpm离心15 min，弃上清。

13、加入500 μL EFW(70%乙醇)洗涤沉淀，12,000 rpm室温离心5 min，弃上清。

14、重复步骤“13”，尽可能弃上清。

15、敞口放置 5~10 min，使乙醇挥发，用适量EFW溶解沉淀。

常见问题解析：

质粒得率低可能原因及解决办法：

1、菌体未活化，生长效率低，菌量少，需要活化菌种；

2、属于低拷贝质粒。增加菌液的量；

3、Buffer RB 裂解不充分。

质粒纯度差可能原因：

1、未加入RNase A 或RNase A未4 ℃保存；

2、加入Buffer RB 剧烈震荡，使得基因组断裂；

3、加入Buffer RC 操作慢，形成微小沉淀，蛋白质无法被充分漂洗干净；

4、OD260/OD280 比值一般在 1.8-2.0 之间，小于 1.8 可能有蛋白污染，大于 2.0 有部分降解或 RNA 污染。

同科生物简介：成立于2007年，是一家集研发、生产、销售和技术服务于一体专注于生命医学和生物技术领域的高科技企业。主营业务有科研产品、诊断试剂、分子诊断和技术服务等，主要服务于科研机构、大专院校、医院和工业等客户。

生产科研：同科生物搭建多个研发与合作技术平台（博士后实践基地、院士工作站、同济大学人才培养与产学研合作基地及生物研究中心等），为技术创新提供了坚实的基础保障。拥有三类体外试剂生产中心、仪器生产中心、研发质检实验室等、厂房和实验面积达8000多平米，仪器设备设施先进齐全（包括定量PCR仪、生物安全柜、核酸蛋白测定仪、高压细胞破碎仪、FPLC等系列高端精密仪器设备）。

研发团队：同科拥有一支由中科院院士为顾问，国家千人为首席科学家，以博士硕士为主体的高效的国际化研发团队。研发人员专业涵盖生物化学、分子生物学、临床医学、免疫学、药物制剂、生物技术、遗传学、微生物学、生物工程领域，关联性较大，专业结构合理，且形成互补，在重大项目及关键技术上具备卓越的攻关能力。

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