Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix(Rox Provided Seperately)

产品描述

Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff^® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。本产品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的 Rox 参比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		11204ES03 （1 mL）	11204ES08 （5×1 mL）	11204ES50 （50×1 mL）	11204ES60 （100×1 mL）
11204-A	Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix	1 mL	5 ×1 mL	50 ×1 mL	100 ×1 mL
11204-B	50×Low Rox	40 μL	200 μL	4 ×500 μL	8 ×500 μL
11204-C	50×High Rox	40 μL	200 μL	4 ×500 μL	8 ×500 μL

 

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR® Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

 

注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11123ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

 

反应体系（推荐冰上配制）

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
50×High or Low Rox	1	0.4	1×
模板DNA	X	X	-
无菌超纯水	to 50	to 20	-

【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。

b) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

c) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

d) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

e) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

f) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

扩增程序

三步法程序                                                                                                 两步法程序

循环步骤	温度	时间	循环数		循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1		预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	10 sec	40		变性	95℃	10 sec
退火	55-60℃	20 sec			退火、延伸	60℃	30 sec★	40
延伸	72℃	20 sec★
熔解曲线	仪器默认设置		1		熔解曲线	仪器默认设置		1

【注】：高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2 min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集（★）：请参考仪器说明书设置。 

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

 

引物设计指南

1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60ºC-65ºC为佳。

3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6）设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

适用机型

High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;

Low Rox 适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

不需要Rox校正的仪器型号：

Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;

Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR. 

 

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HB220113