Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay Kit, Hydroxylamine method 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒，羟胺

产品简介

 

超氧化物歧化酶（SOD）是一种在生物体内广泛存在的酶，主要功能是保护细胞免受氧化应激的损伤。SOD通过催化超氧自由基（O^2-）的歧化反应，将其转化为氧气（O₂）和过氧化氢（H₂O₂）。过氧化氢相比超氧自由基，其活性较低，可以被细胞内的其他抗氧化酶等进一步分解，从而减少氧化损伤，保护细胞。高等动物细胞内一般只有存在于细胞质中的SOD即铜锌-SOD（CuZn-SOD）和存在于线粒体中的锰-SOD(Mn-SOD)，低等动物、单细胞生物和植物中除了铜锌-SOD（CuZn-SOD）、锰-SOD(Mn-SOD)，还有铁-SOD（Fe-SOD）。

超氧化物歧化酶活性检测试剂盒（羟胺法）通过黄嘌呤氧化酶法来测定超氧化物歧化酶（SOD）的活力，该方法基于黄嘌呤及其氧化酶反应体系，能够产生超氧阴离子自由基（O^2-）。这些自由基能够进一步氧化羟胺，生成亚硝酸盐。在显色剂的作用下，亚硝酸盐使溶液呈现紫红色。通过使用可见光分光光度计测量溶液的吸光度，可以间接反映亚硝酸盐的浓度。当待测样本中存在SOD时，SOD会抑制超氧阴离子自由基的生成。由于SOD的这种抑制作用，导致形成的亚硝酸盐量减少，从而使得在比色实验中，含有SOD的样本（测定管）的吸光度值低于无SOD的对照样本（对照管）。通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

该试剂盒可测血清、血浆、脑脊液、胸水、腹水、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肾透析液、尿液、肿瘤培养细胞、各种动植物组织细胞、微生物等的SOD活力，且灵敏度较高，IC50=0.05 g/mL，是邻苯三酚法的18倍。
 

组分信息

 

组分编号	组分名称	规格	储存条件	备注
60741-A	试剂一	5 mL	2～8℃，如有结晶，热水溶解后使用	Part 1
60741-B	试剂二	5 mL	2～8℃
60741-C	试剂三	5 mL	2～8℃
60741-D	试剂四稀释液	5 mL	2～8℃
60741-E	试剂五	粉剂×1 支	2～8℃，避光保存
60741-F	试剂六	粉剂×1 支	2～8℃，避光保存
60741-D	试剂四贮备液	350 μL	-15～-25℃	Part 2

 

储存条件

 

2～8℃避光保存，有效期6个月。

 

使用说明

 

【注：正式测定前建议取2-3个预期差异较大的样本做预测定，以使用说明中的第8条样本正常参考值为中间值，分别往上浓缩一倍和往下稀释一倍，做三只样本管和一只对照管进行预试验，以确定最佳取样浓度，取抑制率在45%～50%左右的这一管的样本浓度作为最佳取样浓度。抑制率计算公式：（对照管吸光度-测定管吸光度）÷对照管吸光度×100%】

1 准备仪器

分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（波长为550 nm）；恒温水浴箱（37℃）；台式离心机；漩涡混匀器；移液器；冰乙酸（99%以上）。

2 试剂的前处理

1）试剂一的处理：使用时按1:9的体积比加蒸馏水稀释，配成试剂一应用液。

2）试剂四的处理：350 μL的贮备液与5 mL的稀释液按1∶14比例配制，用多少配多少，现配现用，配成试剂四应用液。

3）试剂五的处理：使用时加蒸馏水37.5 mL，加热至70℃以上溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，补充至37.5 mL。

4）试剂六的处理：使用时加蒸馏水37.5 mL，常温溶解后备用。

5）显色剂的配制：试剂五溶液:试剂六溶液:冰乙酸以3:3:2 的体积比配制，用多少配多少。【注：试剂五、试剂六必须分开进行配制，不可将试剂五、试剂六混合后再进行配制，否则不显色】

3 样品的前处理

1）血清、血浆、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等样本可直接测定，如超过线性范围用生理盐水稀释后测定。

2）组织样本的前处理

准确称取动物组织重量，按重量（g）：体积（mL）=1：9的比例，加入9倍体积的匀浆介质(推荐0.86%或0.9%的生理盐水)，冰水浴条件下机械匀浆，3000转/分，离心10分钟，制备成10%的匀浆液。

3）高脂血症血清（浆）样本的前处理

①轻度高脂血症（外观略有混浊）：加等量的生理盐水稀释，然后进行检测；

②中度高脂血症（外观混浊较明显）：加等量的生理盐水，再加血清1/2量（体积比）的无水乙醇混匀，然后进行检测；

③重度高脂血症：50 μL高脂血清（浆）加生理盐水200 μL混匀，加无水乙醇150 μL，充分混匀1分钟，再加入三氯甲烷150 μL，充分混匀1分钟，3500转/分，离心10分钟，取上清检测。

4）红细胞样本的前处理

a采集新鲜血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50 μL，加入含有1～2 mL生理盐水的刻度离心管中，500～1000转/分,离心10分钟。

b用移液器吸去上清液（要吸干净），留沉淀的红细胞。

c在沉淀的红细胞中加入蒸馏水0.2 mL，混匀，需使红细胞充分溶解（将溶血液对光观看，呈透明状则已充分溶解）。

d加入95%乙醇0.1 mL，振荡30秒。

e加入三氯甲烷（氯仿）0.1 mL置旋涡混匀器充分抽提混匀一分钟，3500转/分，离心8分钟。此时液体分三层：上层为SOD 抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。若上清有混浊可加入少量NaCl后再离心5分钟，即可澄清。记录上清液体积，取5～20 μL，余下的红细胞抽提液可放冰箱冷冻以备后用。【注：最佳取样量要摸索，确定最佳取样量后再按下表进行正式实验。】

大、小鼠可取内眦血，用玻璃毛细管从内眦部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，将血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤

干时温度要低于60℃），再用移液器取50 μL血，作SOD抽提。血量少时可取10～20 μL抗凝全血（做慢性动物试验，

在饲养过程中可以反复取血 5～6次）。

5）植物/药材样本的前处理

准确称取植物组织重量，按重量（g）：体积（mL）=1：4的比例，加入4倍体积的匀浆介质(0.1 mol/L，pH 7.0～7.4的磷酸盐缓冲液,41403ES)，冰水浴条件下机械匀浆，3500～4000 转/分钟，离心10分钟，取上清液进行测定。【注：最佳取样量要摸索，确定最佳取样量后再按下表进行正式实验。】

4 操作步骤

1）调节波长：分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550 nm）。

2）按操作表依次加入各试剂。

试剂	测定管（mL）	对照管（mL）
试剂一应用液	1.0	1.0
样品/蒸馏水	样品0.05	蒸馏水0.05
试剂二	0.1	0.1
试剂三	0.1	0.1
试剂四应用液	0.1	0.1
用旋涡混匀器充分混匀，37℃恒温水浴40分钟，当室温低于20℃时孵育时间可适当延长至45分钟。
显色剂	2.0	2.0
混匀，室温放置10分钟，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。

5 计算公式

1）血清、血浆、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等样本计算公式：

定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

总SOD活力（U/mL）=（对照OD值-测试OD值）÷对照OD值÷50% x 反应体系的稀释倍数 x 样本测试前的稀释倍数

2）动物组织/细胞样本计算公式：

定义：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

总SOD活力（U/mgprot）=（对照OD值-测试OD值）÷对照OD值÷50% x 反应液总体积（mL）÷取样量（mL）÷相同匀浆浓度下的蛋白含量（mgprot/mL）【注：mgprot为毫克蛋白数】¸

3)植物组织匀浆中总SOD活力计算公式：

方法一(根据组织匀浆浓度进行换算)

定义：每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

总SOD活力（U/g组织湿重）=（对照OD值-测试OD值）÷对照OD值÷50% x 反应液总体积（mL）÷取样量（mL）÷匀浆浓度（g/mL）【注：匀浆浓度（g/mL）=组织湿重(g)/匀浆介质体积(mL)】¸

方法二(根据蛋白浓度进行换算)

定义：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

总SOD活力（U/mgprot）=（对照OD值-测试OD值）÷对照OD值÷50% x 反应液总体积（mL）÷取样量（mL）÷相同匀浆浓度下的蛋白含量（mgprot/mL）【注：mgprot为毫克蛋白数】

6 取样浓度参考值

1)人血浆（血清）、1%组织匀浆和胞浆一般为2倍稀释或不稀释；

2)心肌灌流液、肾透析液、白细胞悬液和细胞培养液一般增加取样量到100～200 μL；

3)红细胞抽提液一般要再稀释5倍；

4)小鼠血浆（血清）2.5倍左右稀释；

5)大鼠红细胞抽提液要稀释10倍左右；

6)所有样本用生理盐水或缓冲液稀释1倍后则取样量可加大1倍。

7 最佳取样浓度的调整

若百分抑制率大于60%时（曲线为平坦部分），则需将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于15%时，则需将样品量加大或用更高浓度再测。若百分抑制率大于60％或小于10％，各个测定组的结果在检验运行中常常无显著性差异。

8  样本正常参考值

物种	样本	T-SOD活力范围	参考稀释倍数
小鼠	血清/浆	110.446±21.325 U/mL	2.5倍稀释
	肝组织	269.274±23.448 U/mgprot	稀释到0.25％组织匀浆浓度
	脑组织	108.790±13.494 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	肾组织	154.277±15.646 U/mgprot	稀释到0.5％组织匀浆浓度
	心肌组织	174.330±19.961 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	皮肤组织	69.01+19.95 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	骨骼肌	101.717±12.190 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
大鼠	血清/浆	262.786±23.240 U/mL	10倍稀释
	全血	21.554±2.116 U/mgHb	/
	肝组织	214.689±38.803 U/mgprot	稀释到0.25％组织匀浆浓度
	肾组织	136.825±24.763 U/mgprot	稀释到0.5％组织匀浆浓度
	肠组织	74.738±11.351 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	脑皮质组织	79.037±3.996 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	海马组织	136.863±36.472 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
	心肌组织	128.292±9.219 U/mgprot	稀释到0.5％组织匀浆浓度
	肺组织	35.542±15.465 U/mgprot	稀释到2％组织匀浆浓度
	脑组织	140.177±26.878 U/mgprot	稀释到1％组织匀浆浓度
鸡	血清	213.208±73.368 U/mL	/
兔	血清	429.04+31.60 U/mL	5倍稀释
牛	血清	123.691±20.008 U/mL	/
	胃液	27.880±8.076 U/mL	/
人	血清	104.2+18.8 U/mL	n=100人，2倍稀释
	红细胞	19246+132 U/gHb	n=40人，5倍稀释
	全血	21.554±2.117 U/mgHb	/

 

注意事项

 

1. 为使试剂充分溶解，所有配制的试剂可在测试前一天配好（试剂四除外），测试前试剂及样品稳定至室温后再用。
2. 为避免误差，样品和试剂要垂直加入试管，不要加在管壁上。
3. 水浴或气浴前要用旋涡混匀器充分混匀。
4. 对照管建议做2支，取其平均值；或每9支测定管做1支对照管。
5. 高等动物体中只有二种CuZn-SOD与Mn-SOD，二者相加等于T-SOD；单细胞动物及植物中还含有Fe-SOD，所以同一份标本测T-SOD与Mn-SOD或者是测T-SOD与CuZn-SOD时，或者是测T-SOD与Fe-SOD时只需测其中一对即可。
6. 使用抗凝剂收集血浆时，不能用EDTA作为抗凝剂，因为EDTA会螯合重金属酶，导致SOD活性降低。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
8. 本产品仅作科研用途！

 

Ver.CN20241104