pH显色法可冻干-RT-LAMP pH Sensitive Dye Chromogenic Version Freeze-Dryable Kit（含冻干保护剂）

 

本产品将LAMP可视光染料整合到buffer中，buffer中含dATP、dCTP、dGTP和dUTP等Bst II DNA Polymerase扩增必须的组分，同时包含pH敏感指示剂，试剂盒含有无甘油Bst II DNA Polymerase、UDGase、RT enzyme等，可用于冻干反应体系的配制，同时含有冻干保护剂，可以直接上冻干机冻干。本试剂具有较高的扩增效率和灵敏度，扩增结果可肉眼判断，阳性反应孔为橙黄色，阴性反应空为洋红色，反差极大。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		13920ES60 (100 T)	13920ES80 (1000 T)	13920ES92 (10000 T)
13920-A	2.5×pH Sensitive Reation Buffer	1 mL	10 mL	100 mL
13920-B	无甘油RT酶Mix	50 μL	500 μL	5 mL
13920-C	无甘油Bst酶	30 μL	300 μL	3 mL
13920-D	冻干保护剂	500 μL	5 mL	50 mL

 

运输与保存方法

Part I：组分13920-A/D【2.5×pH Sensitive Reation Buffer/冻干保护剂】干冰运输，-20°C保存，有效期6个月。

Prat II：组分13920-B/C【无甘油RT酶Mix/Bst酶】冰袋运输，4°C保存，有效期3个月。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读说明书。

2. 整个实验，应规范操作，包括反应体系的配制、样本处理及加样。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1. 待检样本准备

核酸提取后样本：直接作为模板，加入反应体系中。

煮沸法：临床采集的拭子样本直接放入水中，置于95°C水浴锅或金属浴中进行5 min的热裂解，释放核酸，混匀后即可作为模板加入反应体系中。

【注】：

1）处理样本的试剂不能使用强酸或强碱的核酸释放剂，若必须使用，则样本处理完后，需将样本的pH调节至8.0。

2）加入的样本中，避免使用Tris-HCl等高浓度的缓冲体系，避免pH指示剂不能发生变色，影响实验结果判读。

 

2. 冻干上机反应体系配置

将A组分从-20°C取出，溶解后颠倒混匀，瞬时离心确保所有液体落到管底。根据待检测样品量，配制如下体系（通常实验需要设置阴性对照和阳性对照）：

组分	单次反应体积（μL）	终浓度
2.5×pH Sensitive Reation Buffer	10	1×
Bst酶	0.3-1.2	0.32U/μL-1.28U/μL
RT酶Mix	0.5	-
10×Primers a	2.5	1×
冻干保护剂	5	-

a【注】：不同引物的最适Bst 酶用量不同，更换引物建议按照推荐的酶量梯度筛选最适酶用量。

 

3. 冻干上机

3.1 辅料配方发生微量的变化，需重新测定冻干参数，并做相应调整。

3.2 各组份使用前充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。反应体系配制好后，建议震荡5-10 s后瞬时离心再上机。冻干粉8联排管盖为冻干试剂制备专用，上机时请更换普通8 联排管盖。

3.3 冻干设备要求：

冷阱盘管表面温度≤-60°C

板层温度≤-45°C，温度均一性±1°C（性能详细说明及验证方案咨询翌圣生物技术人员）

可做压升测试（冻干生产前，做泄漏率测试）

3.4 环境要求：

溶液分装及配置尽量在万级层流保护下进行，环境空间尘埃掉落进溶液中成为冻干过程的晶核，影响溶液的结晶的过冷度，导致产品质量不一致性。

3.5 真空控制

掺气方式：建议掺入气体为高纯氮气

3.6 冻干试剂 MIX 工艺参数设定参考（冻干设备升华效率≥1mm/小时）

		温度	斜率时间	时间	真空 Pa	备注
预冻	1	-45°C	——	2 h	——	常温最快速率降温
	2	-45°C	——	——	——	保持，根据包材验证保持时间
真空	3	-45°C	——	——	15
升华阶段	4	-40°C		10 h	15	无斜率控制型冻干机，可分6个阶段升温
	5	0°C	2 h	0 h	15
	6	25°C	2 h	4 h	15
解析干燥	7	30°C	——	2 h	0
含水量控制	8	压升测试重试时间：30 min				压升测试：2 min<5 Pa

3.7 实验过程中请使用RNase free耗材。

3.8 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

4.冻干粉使用

组分	单次反应体积（μL）	终浓度
DEPC H2O 复溶	20	1×
模板	5	-

【注】： 1）各组份使用前充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。反应体系配制好后，建议震荡5-10 s后瞬时离心再上机；                          

2）冻干粉8联排管盖为冻干试剂制备专用，上机时请更换普通8 联排管盖。

 

5. 反应孔设置：

1）阴性对照推荐设置空白（不加模板）对照以及NTC（一般为水）对照。

2）10×Primers：16 µM FIP/BIP，2 µM F3/B3，4 µM Loop F/B each。

3）模板加入量在1-8 µL内调整；推荐模板DNA溶解于去离子水中。

 

6. 加样

1）如果反应是在水浴锅中进行，则每管加入20 μL矿物油（自备），以防止液体蒸发导致结果的误差。如果反应是在PCR仪中进行，不需要加矿物油（请开启热盖）。

2）为避免污染，建议用户在超净台中配制组分，在其他房间的通风橱中加入模板以免出现假阳性结果。

3）由于本试剂使用的是pH指示剂法，该试剂中的缓冲液能力较弱，试剂不可长期接触空气，否则会吸附空气中的二氧化碳致使试剂变酸，导致试剂颜色变浅，影响实验结果判读。

 

7. 反应条件

温度	时间	作用
25-37°C	2-5 min	降解含U模板
60-65°C	30 min	恒温扩增
85°C	5 min	失活

【注】：

1）本试剂盒所用酶对温度非常敏感，强烈建议使用PCR仪操作；如用水浴锅，应先加热使其达到规定温度后再反应。温差超过2°C，将导致扩增效率降低，使阳性反应无法在说明书规定的时间内洋红色变成橙黄色。

2）反应温度需要根据引物的Tm值进行调整。

3）反应时间依据模板浓度而定，低浓度模板可能需要60 min时间才能有比较明显的反应。

 

8. 结果判断

反应30 min后，立刻取出反应管，待降温至室温后，置于光线良好的环境中观察（建议以白纸作为背景）。如反应液为洋红色，则为阴性结果；如反应液为橙黄色则为阳性结果。

【注】：反应的时间必须准确计时，超过说明书规定的反应时间可能会出现假阳性。反应管不可开盖，否则会污染，影响后续实验。

HB221114