聚合酶链式反应的克隆PCR产物

1、什么是PCR

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，其是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术。这种技术模拟体内DNA的天然复制过程，能将微量的DNA进行特异性的扩增，在短时间内获得足够的DNA，是分子生物学研究中不可缺少的一员。

2、标准PCR的过程

此项技术是模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，在整个PCR过程中包含了变性——退火（复性）——延伸三个基本反应步骤。

• DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

• 退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

• 延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

3、为什么要使用梯度PCR仪呢

梯度PCR仪是指一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件的仪器，因为不同的DNA片段其最适退火温度不同，采用梯度PCR仪通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适退火温度，优化反应条件，进行有效的扩增。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

使用普通的PCR仪进行扩增时，只能运行一个特定的退火温度，当目的基因的退火温度不适时，就可能出现假阳性，影响实验结果。而对于梯度PCR仪，不但可以作为普通PCR仪使用，也可以通过设置不同的温度梯度（通常为12个梯度温度），研究未知DNA退火温度的扩增，有效降低或避免假阳性，同时在不理想的工作条件下扩增出产物，既节约成本也提高了实验效率。

适用于分子生物学、微生物学、遗传学、细胞生物学、食品科学和农学等领域，进行分子克隆、基因表达分析、基因型鉴定、测序、病原微生物分析等实验研究。

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