伏曲酵母菌的分类鉴定及来源分析的研究
王世宽h2，潘明“‘，侯华‘，张强h。，于海先1
(1．四川理T学院争物工程学院，四川自贡643000；2．酿酒生物技术及应用四川省ZD实验室，四川自贡643000)
摘要：目的：统计分析酵母菌的来源，为大曲微生物物种及其来源变化提供基础资料。方法：利用Biolog微生物自动分析系
统进行精确鉴定，并通过统计分析得出微生物菌种的来源。结果：从伏曲样品中分离纯化出7株酵母菌J—l，2，3，4，5，6，7，利用
Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定，确定其分别为自吉利丝孢酵母A、无名假丝酵母菌、汉逊德巴利酵母c、海隐球酵母菌、东
方伊萨酵母菌、解脂耶罗威亚酵母菌、皱落假丝酵母菌。这些物种主要来源于原料本身和空气，原料为了人室大曲提供了J—l，
2，3三种酵母菌，其比例为25．45％、19．23％和7．5％。结论：空气巾含有大曲中所有的酵母菌的种类，曲房空气中的酵母菌数量
和种类均较多。
关键词：伏曲；酵母菌；分类鉴定；来源
中图分类号：Q939．II+2 文献标识码：A 文章编号：1004-311x(20lo)02-0037—09
Study of Classification and Identification to Yeast Strains and the Source
WANG Shi—kuank。，PAN ruin91”，HOU Hual。ZHANG Qian91”，YU Hai—guan91，
(1．Bioengineering Deptutment of Sichuan University of Science and Engineering。Zigong 643000，China；
2．Liquor Marking Biological Technology and Application of Key Laboratory of Siehuan Province，Zigong 643000，China)
Abstract：Objective：The SOUlice$of yeast were abtained by statistic and analysis．which provided basic data of Duqu microorganism species
and their goulrc虻s and changes．Method：Biolog automated microbes identification system(Biolog System)was used to identificated．
and the sou批s of microorganism species were obtained by statistic and analysis．Result：Biolog automated microbes identification system
(Biolog System)was used to check seven yeast stlains J—l，2，3，4，5，6，7，which wel'E separated and purified from fermented grains of
summer Daqu．They were identified as Trichospor beigelii A；Candida无‘，，m缸，Cryptococcus marinus，Debaryomyces hansenii C，Issatchenkia
orientalis，Yarrowia却咖池，Candida rugom B．These species mainly come from raw material and air，law material provided J—l，2，3
three yeasts to Daqu，and which ratio were 25．45％，19．23％and 7．5％．Conclusion：Air contains all the types of Daqu yeast。the
number and species of yeast were more in Qu—loom．
Key words：Daqu：yeast；biolog automated microbes identlilcatioll system；source
四川泸州地处潮湿的河谷地带，温度较高，湿度较大，有
利于微生物的生长繁殖，为优质的泸州大曲提供了天然的生
态环境。大曲是微生物的大本营，也是酶的贮存库，国外在我
国曲中分离出许多优良菌种，文献报到这些微生物主要是由
原料带来的，原料上附着的微生物种类及数量，对大曲质量起
到支配地位??。在大曲的制作和培养过程中，空气所携带的
微生物也是大曲菌系重要来源之一。
众所周知，酵母菌在原料淀粉质的糖化、洒精的生成和香
气物质的形成等方面起着莺要作用，随着发酵的进行，酵母菌
种群结构会产生变化，因此对大曲中酵母菌的种属鉴定对自
收稿日期：2009—06—29；修回日期：2009—09一17
基金项目：Pq川省教育厅蓬大培育项日(07ZZ018)资助
作者简介：王世宽(1964一)。男。教授．硕士。从事农产品储藏与加工方
面的研究。·通讯作者：于海光。Email：yuhaiguan9123@126．coul。
酒生产有重要的指导意义。美国Biolog公司的Biolog微生物
自动分析系统，可以鉴定包括细菌、酵母、丝状真菌在内的近
2 000种微生物。Biolog微生物自动鉴定系统能利用计算机进
行数据分析，自动化和标准化程度高，鉴定范围大、速度快，目
前已成为微生物分类鉴定常用的技术手段忙JJ。
本研究在利用Biolog微生物自动分析系统精确鉴定的基
础上，统计分析每种酵母菌来源的，为大曲微生物物种及其来
源变化提供基础资料o
l材料与方法
1．1材料
1．1．1实验材料
1．1．1．1样品：样品l：。久香”牌包包曲，由泸州老窖生物工
程有限责任公司提供；样品2：生产大曲的小麦原料；样品3：
空气(曲房、生产车间和厂区)。
万方数据
38 生物技术
1．1．1．2空气样品的采集：采样时在曲厂外，分为4个方向，
每个方向布3个点，每隔500m布2个点，每个方向整体呈S
型随机布点。厂区之内随机布点：制曲车间和曲房布点时采
取对角线布点，每条对角线取5点布皿。采用平皿落菌法：取
不同的培养基制成平板，在测定环境中选择具有代表性的5
个点，揭开皿盖，分别暴露于待测空气中5min。
1．1．2培养基：麦芽汁培养基一J，BUY培养基(Biolog专用于
培养酵母菌的培养基)”j。
1．1．3仪器：Biolog微生物自动鉴定系统(美国Biolog公司)，
超净工作台(苏州净化设备有限公司)。
1．2方法
1．2．1酵母菌的分离：平m稀释法峥1和空气沉降法。
1．2．2伏曲和原料菌悬液的制备
无菌条件下，取109伏曲和原料样品，加入100mL无菌
水。充分摇匀，自然沉淀后取上清液，得到lO。1稀释样。然后
依次制成lO～～lO。稀释样。
1．2．3富集培养
从IO～一lO。菌种液中，各取0．5mL于含马铃薯液体培
养基的试管中，在28℃下恒温培养48h后，根据菌种的生长状
况，选取适当的试管，将其培养液转接于另一管新鲜培养基
中，依照此法转接2—3次，冉进行分离。
1．2．4平板分离
将富集培养液作适当稀释，取0．5mL注入马铃薯培养基
琼脂平皿上，用玻棒均匀涂布，于28"(3培养48h，根据菌落特征
及镜检确认为酵母菌后，挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌
株移入斜面，备用。
1．2．5菌种鉴定：Biolog微生物自动鉴定系统鉴定”1。
2结果与分析
2．1 大曲培养过程中酵母茵的鉴定结果
Biolog系统鉴定结果主要有3个参数，即可能性(Probabil．
ity，PROB)、相似(Similarity，SIM)和位距(Distance，DIST)，其
中SIM值和DIST值是两个蕈要参数，DIST值表示测试结果与
数据库相应数据条的位置，SIM值表示测试结果与数据库相应
数据条的相似程度。Biolog系统规定：酵母菌的SIM值在培养
24h时应≥0．75，培养48h或72h时，SIM值>0．50，系统自动
给出鉴定结果为种名。DIST值45．0，SIM值越接近1．00，表
明鉴定结果的可靠性越高。当SIM值小于0．5，但鉴定结果中
属名相同的结果的SIM值之和大于0．5时，自动给出的鉴定
结果为属名。酵母的鉴定结果见表l。
裹I Biolog系统对J一1，2。3。4。5，6。7的鉴定结果
Table I Identification result of Biolog System to J一1，2．3。4．5．6。7
由表l可以看出，J系列的酵母菌在系统下得到的3个参
数都比较理想，培养48h或72h时，SIM值均大于0．50，可能性
均在90％以上，与数据库有一个良好的匹配，在ID地址栏显
示出有一个Z佳的匹配名称分别是Trichosporon beigelii A(白
吉利丝孢酵母A)、Candida扣，舭抛(无名假丝酵母)、Cryptocoecm
marinus(汉逊德巴利酵母C)、Debaryomyces hansenii C(海
隐球酵母菌)、lt心atchenkia orientalis(东方伊萨酵母菌)、Yarrowia
lipolytica(解脂耶罗威亚酵母菌)、Candida rugosa B(皱落假
丝酵母菌)。另外在名称栏里还有10个名称作为参考，它们
在排列空间上是与diyi菌种Z接近的9个菌种，文章只列出
Z佳匹配的菌种。
2．2整个发酵期酵母茵的分布情况
550
2010年20(2)
l 3 5 7 9 20 40
时间∞
圈I 发酵期酵母菌种类及数量的变化
Fig．1 Changes of yeast species and number on ferment stage
从图l可以看出主要出现了5种酵母菌J—l，2，3，4，5，
分别白吉利丝孢酵母A、无名假丝酵母菌、汉逊德巴利酵母c、
海隐球酵母菌、东方伊萨酵母菌。J—l在发酵的9d里数量都
不是很多。并在第5d没有出现；J一2，4，5在第3d达到Z大；J
一3在第5d达到了Z大值。J一6，7主要从堆积转化期和储存
期才开始出现的，数量不大，主要因为在堆积转化阶段和储存
阶段大曲和空气的接触的时间很长，空气中的一些酵母菌被
富集到了大曲的表面。
2．3小麦原料中酵母茵的分布情况
圈2小麦和入窒曲酵母菌数■的比较圈
Fig．2 Yeast number oDmpagison figure of wheat and the first day Daqu
从图2可以看出小麦和入室曲中酵母菌数量的分布情
况．刚入室的曲酵母菌的主要来源是小麦原料本身，主要有三
种酵母菌J—l，2，3。分别占到25．45％、19．23％和7．5％。曲
坯上栖息大量野生微生物，代谢出各式各样的酶系，在多种酶
的共同作用下生产出白酒有关的香气。麸曲由于纯种培养只
用一种霉菌，因为酶系单一，所以风味单调，这说明大曲酿制
白酒所产的香味，是多种微生物协同作用的结果。从数据上
看，原料上附着的微生物种类及数量都对大曲前期发酵有重
要的影响。有鉴于此，各企业应制订大曲原料标准，严格控制
曲原料质量，其中原料附着微生物检验尤为重要，对大曲里面
的微生物分析有指导性的意义。
2．4空气中酵母茵的分布情况
从表2可以看出，曲房中的酵母菌主要有J一1，2，3，4，5，
大曲生产车间的酵母菌主要有J—l，2，3，4，5，7，厂区的酵母
菌的种类较多J一3，4，5，6，7，三地空气中所检测的曲房酵母
菌的数量Z多，可能是曲房的长期培养大曲，加上曲房的空气
流动性差，使其空气中积累了大量的酵母。生产车间的酵母
菌的种类Z多。厂区空气中J一6，7含量很大，为储存期的酵
母菌提供了来源。从发酵过程来看，除了原料对大曲微生物
的来源影响很大，空气也是一个很主要的影响因素，堆积转化
期和储存期所检测到的微牛物就来自空气。因为不同海拔高
度的空气，其微生物种群和数量不同．所以对曲房周嗣的空气
长期检测，形成一种特有的微生物环境，使曲房周围的微生物
种类趋于稳定，可使大曲中微生物菌系的形成趋于稳定，对大
∞
∞
卯
卯
∞
卯
4
3
2
1
．
一曩∞专畜。flk已凝耱粗
万方数据
2010年20(2)
曲的质Z保证提供保证。
表2 空气酵母菌检测情况及数量表
Table 2 Yeast．umber table in air
生物技术
菌种—面?巡攀署咝监矿
注：空气细菌菌落总数(cfu／m’)=50 000N／AT，A代表甲板面积
(cr02)，T代表平板暴嚣时同(rain)，N代表平均菌落数(era／平板)。
3讨论
经过Biolog微生物自动分析系统成功地鉴定出J一1，2，
3，4，5，6，7七株酵母萧，分别为自吉利丝孢酵母A、无名假丝
酵母菌、汉逊德巴利酵母C、海隐球酵母菌、东方伊萨酵母菌、
解脂耶罗威亚酵母菌、皱落假幺幺酵母菌。说明该系统町用于
大曲微生物鉴定，其鉴定速度快，操作简单，准确性高。从鉴
定结果看，存在部分结果的PROB不高的现象，在排除纯化不
好、培养时间过长或过短、污染、菌细胞太老、培养基错误、接
39
种液浊度凋整不适、培养温度有误的情况下还需迸一步搞清
内因，同时还需优化大曲的分离纯化，以求分离到更多的酵母
菌，为大曲微生物的消长分析提供更加准确的数据资料。
从菌种来源上分析除了原料和空气两大主要因素以外，
还有制曲工具、覆曲稻草等一些囡素有关。从分析结果来看，
原料为大曲提供li{f期酵母菌来源，所以在制曲过程中，除了小
麦颗粒饱满、无虫蛀、无霉味等～些条件以外，对不同来源产
地的小麦的长期微生物监测很有必要的，另外形成一个稳定
的空气外部环境对稳定大曲质量有重要的意义。
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