绿脓杆菌培养基

1.{转载}粪大肠菌群标准检验方法及注解 GB 7918.3-87
化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群及注解
中华人民共和国国家标准

化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群 UDC 668：576 .85.07

(GB7918.3－87)

Standard methods of microbiological examination for cosmetics

Fecal coliforms

粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。

1 方法提要
根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌在44℃培养24～48h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质。

2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐培养基

成分： 蛋白胨 20g

猪胆盐 5g

乳糖 5g

0.4％溴甲酚紫水溶液 2.5ml

蒸馏水 1000ml

制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，加入指示剂，混匀，分装试管(每支试管中加一个小例管)。115℃(10 1b)20min灭菌。

2.2 双倍浓度乳糖胆盐培养基

按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他成分量加倍。

2.3 伊红美蓝(EMB)琼脂

成分：蛋白胨 10g

乳糖 10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂 20g

2％伊红水溶液 20ml

0.5％美蓝水溶液 13ml

蒸馏水 1000ml

制法：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000ml。校正pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，121℃(15 1b)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。

2.4 蛋白胨水(作靛基质试验用)

成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g

氯化钠 5g

蒸馏水 1000ml

制法：将上述成分加热熔化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，高压灭菌121℃(15 1b)15min。

2.5 靛基质试剂

柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml。

试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。

注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

2.6 革兰氏染色法

2.6.1 染液制备

2.6.1.1 结晶紫染色液：

结晶紫 1g

95％酒精 20ml

1％草酸铵水溶液 80ml

将结晶紫溶于洒精中，然后与草酸铵溶液混合。

2.6.1.3 脱色液：95％乙醇。

2.6.1.4 复染液：

a. 沙黄复染液：

沙黄 0.25g

95％酒精 10ml

蒸馏水 90ml

将沙黄溶解于酒精中，然后用蒸馏水稀释。

b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5％石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液。再取此液10ml加水90ml即为稀石碳酸复红液。

2.6.2 染色法

2.6.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

2.6.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

2.6.2.3 滴加95％酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，水洗。

2.6.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。

2.6.3 染色结果

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

注：如用1：10稀释石碳复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。

3 仪器
3.1 恒温水浴或隔水式恒温箱：44℃。

3.2 温度计。

3.3 显微镜。

3.4 载玻片。

3.5 接种环。

3.6 电炉。

3.7 锥形瓶。

3.8 试管。

3.9 小倒管。

3.10 pH计或pH试纸。

3.11 高压消毒锅。

3.12 灭菌吸管。

3.13 灭菌平皿。

4 操作步骤
4.1 取10ml 1：10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

4.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃培养24h。

经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，ZX较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。

4.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

4.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

5 检验结果报告
平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。

附加说明：

本标准由ZG预防医学科学院环境卫生监测所归口。

本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。

本标准主要起草人周淑玉。

本标准由ZG预防医学科学院环境卫生监测所负责解释

注解：
（1）用粪大肠菌群作为化妆品受粪便污染的指示菌是比较合适的。考虑到总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境（水与土壤）中亦经常存在。在粪大肠菌群这一组群细菌中大肠埃希氏菌（E.coli）数量Z多，是较理想的指示菌，但欲正确鉴定此细菌，手续较繁复，因此在化妆品检验中采用粪大肠菌群作为指示菌。

（2）本方法采用乳糖胆盐培养基，是具有选择性作用的培养基。其中胆盐具有YZ革兰氏阳性菌的作用。胆盐的品种来源及用量不同，其YJ效果也不同。目前国内常见的胆盐有国产的生检7号和3号胆盐，进口的Difco和Oxoid，No.3胆盐，以及牛胆盐、羊胆盐、猪胆盐，免胆盐和家禽胆盐等。

有时因某种胆盐不易购得，需用其他胆盐代替时，应重新测定YJ的有效剂量，这些情况给使用者带来不便。经实验观察，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果无明显、差异，可互相替代；而其他胆盐的检验效果则不一致。不宜相互代替。在胆盐用量上，实验表明l％、0.5％和0.25％三个剂量间无何差异，所以本方法采用的胆盐剂量（0.5％）是适宜的，在称量时稍有误差，亦不致影响大肠菌群的检出。

（3）乳糖发酵试验

乳糖发酵试验使用乳糖胆盐发酵培养基，细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖的酶随细菌种类不同而异，可以此鉴别细菌。

大肠杆菌能分解乳糖而产生酸，使培养基的pH降低（指示剂变色）。这一现象可作为观察结果的指标。大肠杆菌细胞在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培养基中产生大量气体而进入倒管中，以观察产气。

在乳糖发酵试验中，经常可以看到在发酵倒管内有极微量的气泡，类似这样的情况能否算产气阴性？一般来说产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但产气量小不一定大肠菌群都是阴性，因此应慎重处理。

对这种产气量小或倒管内虽无气泡，糊液面及管壁可看到缓缓上浮的小气泡的情况时，均应作进一步观察与鉴别。

（4）伊红美兰琼脂分离大肠菌群细菌

大肠菌群细菌发酵乳糟产酸，使伊红与美兰结合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。不发酵乳糖的细菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）则为无色菌落。

粪大肠菌群菌落在伊红美兰琼脂上呈黑紫色有光泽或无光泽的检出率Z高；红色、粉红色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面（如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥等）虽亦应注意，但不如色泽更为重要。

影响粪大肠菌群检出率的因素很多。如化妆品种类，茵落色泽和形态，细菌种类等，如只挑一个菌落，由于机率问题，很难避免假阴性出现，尤其当菌落呈不典型时：因此挑选菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。

表1 粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征

培养基 菌落特征
伊红美国微软公司兰培养基(EMB) 紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、ZX紫黑色、黑红或深紫红色
口红亚硫酸纳(远藤氏平板) 紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽，淡红色、ZX较深
ZG兰平板 深蓝色，浅蓝色、ZX深蓝色
麦康凯平板(Mac C) 桃红色，粉红色、ZX桃红色