求基因免疫的论文

一、基因疫苗的诞生
自1796年英国医生琴娜(Jener)首次采用牛痘苗以来，疫苗已在世界范围内被广泛应用，200多年来各种疫苗已经帮助人类战胜了包括天花在内的多种传染病.然而，现有的疫苗主要有两种：diyi种疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二种疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗。但它存在一些不可忽视的缺陷如:灭活疫苗难以诱发细胞免疫，需多次免疫注射;亚单位疫苗免疫原性差;减毒活疫茵存在毒性回升的危险等问题.因此，现在对一些传染病仍缺乏相应的安全有效的疫苗. 第三代疫苗基因疫苗的问世，为解决这些难题带来了希望.
基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因ZL（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因ZL是从20世纪80年代发展起来用于预防和ZL疾病的Z具革命性的生物医学YL技术，其原理是将人或动物的正常基因或有ZL作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥ZL作用，从而达到ZL疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因ZL试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang 、 DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。（注：1）
概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。
二、核酸免疫的作用机理
目前对核酸免疫作用机理的认识主要还于理论推测，且多数资料来自基因ZL试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，Z终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。
三、基因疫苗质粒载体的构建
获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。
1、编码抗原蛋白基因的分离
制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，Z好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。
2 目的基因质粒的载体构建
基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。（注：9）

八、核酸疫苗的展望
基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标(用一种疫苗预防多种疾病)相吻合。基因疫苗不仅能预防疾病，还可做为ZL用疫苗来ZL一些复杂难治的疾病，例如病毒性肝炎、癌症等。这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景。但是，基因疫苗的历史毕竟很短，实验结果均来自动物，在用人体之前还有许多工作必须完成，其中Z重要的是解决核酸疫苗对人体的安全性和效力问题，如： (一)、须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果；(二)、须用高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA不与宿主细胞基因组DNA整合，这是确保DNA疫苗遗传学安全性的重要指标之一；(三)、Z终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果。
虽然核酸疫苗取代以往的疫苗还有很长的路要走，但相信核酸疫苗的推广应用会得到长远的发展，使该项技术能够更好的为人类服务.

六、基因疫苗的优点和存在的问题
与传统疫苗相比，基因疫苗具有以下显著的优越性：
1、质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输，使用方便。而且制备简单，容易大量生产，成本低。对于毒性大、危险的病毒，以及难以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制备相对安全，容易得多。
2、质粒DNA在宿主体内可较长时间存在，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠。
3、基因疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且可以导致细胞毒T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫，而传统的疫苗只有活苗可诱导细胞免疫，但存在活疫苗的毒力回升的危险。
4、用核心蛋白保守DNA序列制备的基因疫苗对病原体（细菌或病毒）的各变异亚型都可产生免疫应答，从而避免因病原体变异而造成的免疫逃避问题。
5、一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价苗，从而一种基因疫苗可预防多种疾病。
6、质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，至少目前没有检测到抗DNA抗体的报道。另外，基因疫苗还不会受机体已有抗体的影响。作为一类新型疫苗，基因疫苗还有不少需要进一步研究的问题：
1、安全性问题：质粒DNA一般不会整合到宿主细胞的基因组上，目前也未发现插入突变的证据。但不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性。一旦整合到基因组中就可能使细胞癌基因激活或抑癌基因失活。
2、保护效率问题：目前为止，基因疫苗的免疫效率很难达到的免疫保护，且存在明显的种属个体差异，这可能与不同动物细胞需要不同启动子、抗原基因、给YF法途径、给药量有关。
3、免疫耐受问题：基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。（注：8）
七、基因疫苗疫苗的应用
DNA疫苗应用的 域很广，至今已经被用在预防至少 十种传染病的实验上.其中包括病毒，细菌及原虫等各种型式微生物的感染症.也有人把DNA疫苗用在部分传染病的治 上.此外它也被用在某些癌症的预防或ZL上.
(1) B型肝炎。B型肝炎病毒(HBV)的DNA疫苗是目前被研究得Z详细的DNA疫苗之一.现 B型肝炎疫苗的成分是以基因工程技术合成的S抗原制成.一般而言，这种疫苗的效果相当 错.但是免疫 正常的 轻人仍有少於5%的人无法产生足够的抗体.研究发现， 用肌肉注射B型肝炎病毒DNA疫苗即可产生较好的免疫保护:同时产生抗HBV的抗体及细胞毒 性T细胞反应[32，33].对於一部份在接受传统疫苗注射之后，无法产生足够保护 的个体，DNA疫苗也有错的效果[34].在B型肝炎病毒DNA疫苗中，CpG结构小段是很好的免疫激剂，它加强 B型肝炎病毒DNA疫苗的免疫反应[35]. 过在黑猩猩的实验显示，B型肝炎病毒DNA疫苗的效果，依赖的DNA 很大，而且必须一再的追加注射才能维持长期的免疫. 除用在预防B型肝炎病毒感染，也有人 用B型肝炎病毒DNA疫苗治B型肝炎.在一个B型肝炎病毒转殖鼠的研究当中，B型肝炎病毒DNA疫苗成功地诱发 B型肝炎病毒表面抗体， 但清除 血液中的B型肝炎病毒表面抗原，肝细胞中B型肝炎病毒的mRNA也消失，同时并 会对肝细胞本身造成伤害，表示具有B型肝炎病毒特 性的T细胞也 与其中的反应.除动物实验，B型肝炎病毒DNA疫苗的人体实验，包括用在预防及治，都已经展开.结果相当地令人期待. （注：2）
(2) 流行性感冒病毒(Influenza) 。流行性感冒病毒的一个重要特徵是它会 断的突变，主要是其hemagglutinin 及neuraminidase 个表面蛋白会 断变 ，出现新的病毒株，进而导致大规模的传染.现在的去活性疫苗注射，必须预测可能的病毒株，然后再进疫苗的制造.一旦出现预测错误，或有新的病毒株出现，则现有的疫苗可能会无效. 流行性感冒病毒的核蛋白(nucleoproteins， NP)，相对地比较 会有变，可能可以产生跨种病毒的保护 .可惜在自然感染下，核蛋白本身并不足以产生足够的免疫 ，保护宿主免於感染. 关於流行性感冒病毒的DNA疫苗实验，Z早是有人成功地用流行性感冒病毒的hemagglutinin(H7)基因，在鸡上产生保护.此外，针对流行性感冒病毒会不断突变的问题，曾经有人用含有流行性感冒病毒核蛋白基因的DNA疫苗，在鼠体内诱发出针对A型性感冒病毒的保护.这样的结果， 证明能应用在人体身上，将是 性感冒的预防工作上，一个很重要的突破. （注：3）
(3)人类免疫缺陷病毒(HIV) 人类免疫缺陷病毒感染会引起免疫系统崩溃，出现所谓后天免疫缺陷症候群(AIDS)，又称为爱滋病.虽然，随著抗爱滋病药物的研发，爱滋病的ZL已经有许多进展.但是，抗病物的副作用很大; 人类免疫缺陷病毒会一再突变，出现药物的抗药性;并且一旦停药，病毒又将增生，甚至导致发病;再加上药物的费用很昂贵，大部分爱滋病盛行的国家都负担不起.这些因素加在一起，使得爱滋病至今仍然可以算是一种不治之症，.所以面对爱滋病毒的FZ问题，发展一种有效的爱滋病毒疫苗，显然是值得努力的，而且是Z有可能奏效的方向. （注：4）
(4) 结核菌 结核病至今仍是全世界Z重要的传染性疾病之一，尤其在爱滋病及其他免疫缺陷病患的数目增加以后，结核病的重要性又逐渐提高.抗药性结核菌的出现及逐渐普遍，也使得预防结核菌感染日形重要.卡介苗是目前唯yi可以用于预防肺结核的疫苗，但效果有限.在结核菌的慢性感染中，结核菌通常会表现出一些感染晚期特有的蛋白，这些抗原可以引起强 的免疫反应，可能可以用作DNA疫苗的主要成份.动物实验已经证实，含有热休克蛋白65的DNA疫苗，施打在 鼠身上以后，可以减少感染。（注：5）
（5）丙型肝炎DNA疫苗 1996年，Major等将编码HBV核心蛋白的主要抗原决定簇基因与HBV主要蛋白基因融合，构建了重组 HCV DNA疫苗，免疫接种小鼠后，成功地诱导了对两种抗原的免疫应答并检测到了两种病毒的抗体。同年，Tobushige K等将HCV核心蛋白基因的。DNA构建核酸疫苗后，免疫BALB／C小鼠后也产生了针对核心蛋白的免疫应答。
(6)单纯疱疹DNA疫苗　Z近Kriesel等将编码HSV-2型gD2和pRSVnt免疫BALB/c小鼠，13天后用半数致死量的HSV攻击，获得满意结果，而对照组的小鼠均先后死亡，表明单纯疱疹DNA疫苗对动物有保护性作用。
　　(7)疟疾DNA疫苗　1994年Sedegah等构建的质粒DNA中含有编码尤氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCSP)的基因。该疫苗与目前试验中的疫苗(辐射处理的子孢子)相比，能诱导更高水平的抗PyCSP抗体和CTL，并使16只免疫小鼠中的9只获得了对疟原虫感染的防御作用。Z近研究表明疟疾基因疫苗有可能成为Z早用于人类的基因疫苗。