DNA，纯化，表达，连接.

DNA 纯化
在生物技术实验中，我们粗提取的DNA需分离纯化去处蛋白质等杂质，我们都需要将Z终的结果在琼脂糖凝胶， 或PAGE凝胶上走电泳观察，以判断我们实验的正确性以及DNA片段的完整性。同时通过紫外分光光度计测定OD260，OD280的吸收值，以确定DNA的浓度和纯度。
核酸经凝胶电泳后，在EB（溴化乙锭）中浸染，核酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300-360mm波长的紫外光，同时诱发出液长为590nm的红橙色荧光，从而可通过照像机摄影，凝胶成像系统记录实验结果。DNA浓度的计算根据郎伯-比尔定理（E=abc）计算。根据经验1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
实验试剂及器材
酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
70％乙醇 TE buffer
RNase
琼脂糖
TBE电泳缓冲液
电泳设备
紫外分光光度计
凝胶成像系统
1. 加入RNase至终浓度10μg/ul 37℃反应1小时。
2. 加入酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）等体积各抽提2-3次，取上清。
3. 加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，－20℃下10min-30min。
4. 15000rpm，离心10分钟。
5. DNA沉淀用 70％乙醇洗2次， 37℃烘干DNA（无乙醇）。
6. 100μl TE buffer溶解沉淀
7 取20ul DNA母液稀释至1000μl，在紫外分光光度计上测OD260，OD280。
8. 取10 ul DNA， 在 0.8％琼脂糖凝胶120伏，1-2小时电泳，
9. 在凝胶成像系统上记录和分析结果。

DNA 连接
DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源DNA和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到Z佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以YZ载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
1、 不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
2、 对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
3、 平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。
粘性末端连接：
实验试剂：
用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇；
500μl/ml BSA（可用可不用）
T4DNA连接酶
5mM ATP

实验步骤：
1、 在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴5分钟使重新退火的粘端解链， 迅速将混合物转入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl。
2、 盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心5秒。
3、 12℃下过夜连接反应。
4、 反应结束后于－20℃保存。
5、 再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。

注意事项：
1、 连接反应的温度：DNA连接酶的Z适反应温度为37℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜。
2、 DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4、 连接反应的检测：连接反应成功与否，Z后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
5、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

原核表达
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测

真核表达
异源蛋白质在细菌中表达是目前使用的主要的蛋白生产系统。大肠杆菌一直是Z经济的系统之一。然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。富含AT的基因在很多真核细胞中表达时会遭遇很剧烈的障碍。主要的真核信号序列如 加poly-A的位点、酵母转录终止位点和真核mRNA去稳定序列都是富含AT的。内含子序列也趋向于富含AT，尽管他们有参与剪切过程的很特异的识别序列。虽然绝大多数原核基因没有剪切或聚腺苷过程，但这些真核过程需要的保守序列可能存在于原核基因中，因此当这些基因在真核细胞中表达时可能引起特异的问题。而且诸如哺乳动物和单子叶植物细胞的特异真核表达系统可能不能有效地表达无内含子的基因。
真核mRNA在离开细胞核进而在胞浆的核糖体上被翻译前需要特异的处理和修饰。这些过程包括去除内含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。内含子去除需要5'剪切位点、G75/G100U100A6G65U保守序列、3'剪切位点、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一个由两个部分组成的信号：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位点内的50个碱基的富含GT的序列。酵母真核转录终止序列（几个不同的富含AT序列，如含TTTTTATA，TATATA，TACATA，TAGTAGTA的一个38bp区域）被研究的Z清楚。这些结果来自对酵母突变体CYCI mRNA的mRNA水平和相对长度的确定的实验。近期用in vivo质粒稳定性分析的研究结果证明：TATATA似乎和原始的38bp野生型区域一样有效地终止转录，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些，TTTTTTTATA几乎没有效率。所有这些序列在反方向时没有终止转录功能。不幸的是几乎没有其他真核表达系统转录终止序列方面的信息。
内含子对几个哺乳动物基因的正常表达是必需的，包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氢叶酸还原酶基因。单子叶植物细胞充分表达乙醇脱氢酶的cDNA拷贝、报告基因氯霉素乙酰转移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏内含子的基因时也依赖内含子。转录区域内引入内含子可以通过未确定的转录后机制增强表达。（免疫球蛋白基因）内含子可能也包含转录增强子，因此通过转录机制增强表达。