植物体内可溶性蛋白质含量的测定(福林－酚法的原理）点击次数：901 作者：佚名 发表于：2009-04-30 00:00 转载请注明来自丁香园
来源：西昌大学
该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：
（1）在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。
（2）此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸（FolIn试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
一、仪器与用具
试管若干；刻度移液管0?5Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。
二、试剂
Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85%H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。
三、方法
1. 试剂的配制
（1）碱性铜试剂（相当于双缩脲试剂）的制备首先配制A液：4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1Mol NaOH）；B液：1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸钾钠）。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为Folin－酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂（相当于Folin试剂）的配备：称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，浓HCl 100ml，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min）。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使Z终浓度相当于1Mol/L H+酸，此为FolIn-酚试剂乙液（Folin试剂）。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
（2）标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使Z终浓度为250μg/ml。
2. 标准曲线的绘制
（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg（必要时可做重复）。
（2）在每支试管中用定量加样器加入5ml甲液，混匀，于30℃下放置10min。
（3）在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30min
（4）准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品的测定
（1）样品的提取：称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。
取1.0ml（视蛋白质含量适当稀释）样液加入试管中，然后重复步骤2的（2）、（3）、（4），以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
（2）根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。
4. 结果计算
样品中蛋白的含量（mg/g）=C×VTV1×FW×1000 （2-1）
式中C：查标准曲线值（μg）；VT：提取液总体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；V1：测定时加样量（ml）。
四、注意
还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
考马斯亮兰法考马斯亮兰 （一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度Z高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的Z大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其Z低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性Z好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支
（三）操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。Z后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
（3）用标准蛋白质量（mg）为横坐标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml， 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O， 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml， 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
