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用TAIL-PCR扩增转基因的侧翼序列,从两端扩结果都是载体上的序列

探独峡呜    2011-06-23    基因扩增仪    浏览 364 次

我做的是转基因整合位点的检测,用的是TAIL-PCR技术,做载体线性化时用的是单酶切,在距离酶切位点300-500bp处的两端我分别设计引物做TAIL-PCR,产物都在1000bp以上,侧序后刨除那300-500bp 后,剩下的碱基就应该是整合在基因组上的序列才对啊,可是还是载体上... 我做的是转基因整合位点的检测,用的是TAIL-PCR技术,做载体线性化时用的是单酶切,在距离酶切位点300-500bp处的两端我分别设计引物做TAIL-PCR,产物都在1000bp以上,侧序后刨除那300-500bp 后,剩下的碱基就应该是整合在基因组上的序列才对啊,可是还是载体上的序列(比如扩增3‘,载体上的序列指的是5’的碱基),难道是酶切失败,还是说酶切后又自连,整个环状质粒载进去了。那如果是环状的质粒还能整合到基因组中吗?还能表达吗?

大家有没有遇到过这种情况啊?下一步我该怎么做呢?求大家帮帮我吧,现在是一点头绪也没有啦!

精彩问答
我前天订的 发布日期:2011-06-25
我说说我的理解,仅供参考:

你本来的意图,是通过载体线性化后,外源基因与基因组同源位点的双交换,将其整合入基因组中,对吗?

如果说是整个环状质粒导入基因组,从理论上来说是有可能的,单酶切就可以了,而且概率比双酶切还要高,虽然我们一般都用线性材料转基因。

如果想验证一下是不是质粒整合进入的,我觉得既然TAIL-PCR就是做染色体步查的,如果你有时间,再往前走一段看看。

不过如果是环状整合的话,基因组有很大一段插入,从理论上是不能表达了。
全部评论
十几年x 发布日期:2011-06-24
这个是得问 专业人士
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