PCR技术因其快速、灵敏、特异等特性广泛应用于分子生物学的研究与检测中,但却对实验环境及操作有着严格的要求,稍有不当则会导致假阳性产生。污染严重时甚至可以持续数月,很难在短时间内控制。换引物、换试剂、换耗材、换实验楼,甚至有人跑到两公里外的实验室加样也无济于事,如何避免及处理假阳性问题已经成为每一位PCR实验人员的必修课。
01 什么是PCR假阳性
假阳性结果示例1(Q1600荧光检测)
PCR假阳性包括两种,即检测阴性材料得到阳性结果,检测空白对照(加入去离子水)出现阳性结果,实验中设立的阴性对照可以提示有无假阳性结果出现。
假阳性结果示例2(Repure-A电泳检测)
02 PCR假阳性的原因有哪些
PCR扩增产物污染是导致假阳性的重要因素,因其拷贝量大,微量的污染源即可导致阳性结果,其中以气溶胶污染最为常见。其次,PCR试剂及样本的交叉污染也会导致假阳性。PCR试剂的污染包括加样枪、容器、双蒸水及其它溶液的核酸污染,样本污染主要是取样工具之间的交叉污染或加样污染。
此外,在实验室操作中经常会用到阳性参考品,参考品大多数由某些克隆质粒制作而成,克隆质粒使用不当也会造成污染。
03 假阳性的预防及解决措施
①规范实验室设计:实验室包括配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区,在连续独立的空间完成不同实验操作。若没有专业的实验室,至少需要保证配液、加样与检测在不同的区域;
②规范实验室操作:实验室定期通风与消毒,仪器定期清洁,并使用气溶胶清除剂。使用一次性用具,小心操作,避免交叉污染;
③规范试剂耗材管理:新买试剂需进行实验前验证并进行分装,所用耗材需高压消毒;
④实验前预防:首先需保证所设计引物的特异性,防止引物自扩增,其次还可使用UNG酶及dUTP防污染体系;
⑤污染后处理:如遇污染应立即停止实验,采取开窗通风,紫外灯照射,喷雾装置喷洒等操作,此后若连续三天阴性对照正常即可恢复正常实验。
04 二维梯度PCR可有效避免多次PCR带来的假阳性风险
DY轮PCR的污染基本可以避免,PCR实验越频繁,则越容易污染,能一次做50个,不要分开5次每次做10个。而对于科研实验而言,使用二维梯度PCR可以一次得到96个温度组合,而不需要分开8次,每次做12个梯度,在节省人力物力的同时也大大降低了假阳性的风险。
RePure-D 二维复合梯度基因扩增仪
RePure-C 二维梯度基因扩增仪
“上YZ未病”,对于PCR的初学者而言,做实验之前首先需要树立“预防”的观念,严格把控样本处理、核酸提取、扩增及检测的每一过程。同时,在实际操作中也需要注意规范实验步骤,避免因加样失误而导致的交叉污染,从源头杜绝假阳性现象。
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