十几年x
发布日期：2017-01-20
基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的，PCR之后可以通过产量的多寡来判断。但是普通PCR一般只能定性判断基因表达量，实时荧光定量PCR可以通过PCR扩增来定量计算RNA含量（通过比较内参的ct值）。所以，传统曲线只能定性判断，实时荧光定量PCR曲线可以定性判断。
PCR有两种解释：
1，Z常用的理解：RT 是‘逆转录’（reverse transcription）的缩写
2，现在也有人这么用：RT是‘实时’（real time）的缩写
1，先说逆转录PCR：
这项技术使用的‘逆转录酶’来自逆转录病毒，是一种能按照碱基互补配对原则，以脱氧核糖核苷酸为底物，以寡居dT为引物，把mRNA转换成相应DNA的酶，由于该酶的效果与ZX法则（DNA所承载的生物信息表达顺序应该是DNA-RNA-蛋白）顺序相反，故而有'逆转录'之称。
由于逆转录反应使用了引物和模板，也是聚合酶链式扩增的（PCR是‘链式扩增反应’polymerase chain reaction 的缩写）故称为RT-PCR。
再说其用途：
我们提取的RNA主要是rRNA，即核糖体RNA，但很少有人用它做些什么，倒是含量较少的mRNA，即信使RNA是ZX法则所述的遗传信息表现的中转站，所以我们要把微量的信使RNA搞出来，更重要的是，RNA太容易分解了，环境中无处不在的RNA酶啊，以及其容易被水解的特点啊，让你不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式，于是就有了RT-PCR。
2， 再说实时PCR
细胞瞬时转录的mRNA种类颇多，各种mRNA含量也有实时的改变，这反映了细胞核内转录因子根据环境要求在做出相应的变化，realtime-PCR，以及quantitative realtime-PCR （简称qRT-PCR）就应运而生。
原理：利用PCR高度的特异性，通过特定的引物能在复杂样品中得到的特定序列的DNA，而这种特定DNA的产量跟反应初始阶段模板量是直接相关的。简单说来。经过一个PCR循环，可以把一个模板变成两个，在经过一个循环，就会变成四个，以此类推。如果PCR的检测线是1000个产物，那么当你的初始样品中模板是n个，那就需要经历的循环数为
的时候才能检测，这就把循环数与初始样品中模板数联系起来了。也就是说经过计算，达到检测限的循环数就能反映初始RNA样品中某种RNA的含量多少。
在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。
realtime-PCR有两种。定量和相对定量。
定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测，比如你想知道有多少HIV侵染了样本中的T细胞，你可以收集一定数量的T细胞并提取RNA，通过逆转录，以及taq酶利用HIV的特异引物进行扩增，Z终的循环数可以反应你的这群T细胞正在被多少个HIV侵染。
相对定量常用于检测实时的转录谱，例如在给药前后，某重要基因转录的实时变化，可以分别收取给药前后的全RNA，用相对转录量不变的基因为内参，如GAPDH或beta-actin，与目标基因转录的转录量对比，来定量反应药物对目的基因转录含量的影响。
