--基因ZL与AAV--
基因ZL是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,从而达到ZL目的。所有基因疗法都利用病毒或非病毒载体将DNA或RNA输送到宿主细胞中。与非病毒载体(如阳离子脂质或化学载体)相比,病毒载体感染宿主细胞的效率更高,但同时它们可能具有免疫原性副作用。因此,在开发药物时,选择合适的病毒载体是至关重要的组成部分。
腺病毒相关病毒(Adenovirus Associated Virus,AAV)
AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb,无包膜,外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制,只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时,才能进行复制和溶细胞性感染。腺相关病毒(AAV)作为一种安全有效的载体,目前已应用于多个临床试验。
临床研究项目中AAV1和AAV2约占50%
--质量控制--
--Wes全自动定量Western Blot
在AAV生产过程中,使用SDS-PAGE通过Western Blot来鉴定蛋白。然而,传统的Western Blot手动操作繁琐,重复性差,并且仅是半定量,不宜用于工业产品质量控制。
Wes全自动定量western以其独特优势逐渐替换传统western blot,可用于新型AAV衣壳的表达到下游制造全程质量控制中。
鉴定衣壳蛋白VP1/2/3
鉴定杂质
筛选抗体
检测动态范围
将市售AAV2(1x1013 GC/mL,33.8μg/mL)进行从1:8至1:256的2X倍比稀释,Wes检测VP1/VP2/VP3。
--Maurice表征AAV电荷异质性
与所有ZL药物一样,基因疗法,需要表征包装药物的递送载体电荷等。使用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(icIEF)来表征AAV的电荷异质性,可以确保产品的稳定性和一致性。
Maurice兼具CE-SDS和iCIEF双功能。两种功能均入选国家药典。
自发荧光和紫外吸光度比较
Maurice同时兼具紫外吸光度和自发荧光检测通道。与吸收检测相比,自发荧光的灵敏度高3-5倍,可以更好检测出AAV特征性异构体峰。因而自发荧光模式更适合AAV病毒电荷表征。
Intra-assay CV
AAV2和AAV6样品一式四份进样,检测Intra-assay重现性(图2)。结果显示其高重现性:AAV2和AAV6的%RSD分别为3.95%和4.30%(表1)。
Inter-assay CV
AAV6样品三次独立实验,每次实验三次重复,来检测Inter-assay重现性(图3)。%RSD为6.6%(表2)。
变性AAV蛋白电荷表征
致载体活性,衣壳装配和转导效率降低1。icIEF方法通常用于监测由唾液酸化,糖基化和脱酰胺作用诱导的单克隆抗体的电荷异质性,因此对AAV病毒蛋白也进行类似的评估。使用一式三份电泳图叠加使用吸光度和自发荧光检测法进行评估,AAV2电荷变异体可以清晰分辨和重现(图4)。
灵敏度及线性
将变性的AAV2从〜3 x 1012 GC/mL连续滴定至〜3 x 1011 GC/mL(图6)以建立方法的灵敏度。该滴定范围内观察到很强的线性相关性,R2为0.9956。
监测AAV颗粒稳定性
对完整的AAV样品进行温度压力测试,以确定是否可以使用Maurice监测病毒载体的稳定性或衣壳蛋白脱酰胺。
AAV6颗粒非常稳定,在37°C或50°C下保持10分钟完整无缺。但是,当AAV6颗粒在60°C下10分钟时,不稳定。
监控AAV批间差
利用Maurice icIEF天然荧光监测批次间变异,以鉴别病毒载体批间差别。五批不同的AAV6,每批具有不同的基因组含量/mL(GC/mL),Maurice icIEF自发荧光分析(图9)。结果显示,所有五个批次在pI〜9.25左右均产生相似的峰形。但是,在一批中观察到了一个较低pI的附加峰,表明该样品与其他四批样品不同。
主要参考资料
1. Deamidation of amino acids on the surface of adeno-associated virus capsids leads to charge heterogeneity and altered vector function, AR Giles, JJ Sims, KB Turner, L Govindasamy, MR Alvira, M Lock, JM Wilson, Mol Ther, 2018; 26(12):2848-2862.
2.Dan Wang, Phillip W. L. Tai and Guangping Gao,Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery,Nature Reviews Drug Discovery,2019
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