实时荧光PCR法的质控要求及评价指标

1、为什么实时荧光PCR法要用质控

由于在样本处理、核酸提取、PCR扩增整个过程中存在试剂/设备不稳定、核酸提取效率低、样本交叉污染等问题，所以需要设置质控体系监控核酸提取和PCR扩增全过程。质控体系可以降低实验误差，保证样本检测的准确性，同时避免检测过程中的假阴性和假阳性。

2、质控体系质控品的组成

阳性对照（PC）：监控系统故障，一般为含目的成分或片段的质粒。

阴性对照（NC）：监控反应体系污染情况，一般为不含目的成分或片段的质粒。

无模板对照（NTC）：监控反应体系污染情况，一般为去离子水。

内标（内参）：校准生物学误差，判断核酸提取有效性及扩增效率。

重复实验：降低其余误差，一般为2-3次以上。

GB∕T38164-2019 动物源性成分检测方法质控品设置示例

动物源性检测操作中对内参基因18SrRNA进行检测的方法可在第二通道中进行设置。单通道产品则可在B槽中进行，设置同A槽。 

3、质控体系设置要求及过程控制

一般无特殊要求的实验需要设置阴阳性对照，如非洲猪瘟病毒检测（TCVMA 5-2018），食源性致病菌检测等（SNT1870-2016），要求严格的实验还需设置内参并进行2-3个平行实验，如动物源性检测（GB∕T38164-2019），转基因定量实验等（GBT19495.5-2018）。

对于涉及人体样本的临床诊断而言，除质控品设置外，还需对整个核酸提取和PCR扩增过程进行质量控制。如诺如病毒检测（GB 4789.42-2016），新冠病毒检测等。

在实际实验过程中，需综合考虑实验环境、操作流程、实验成本等实际条件，以便选择适宜的方法进行质量控制。

（1）扩增控制示例（A5-A7）

GB 4789.42-2016 诺如病毒检验 扩增控制示例

规则：YZ指数<2.00，扩增实验成立，反之，则反应无效。

方法：YZ指数=A6Ct值-A5Ct值，满足条件，则使用A1孔Ct值作为结果；若不满足，则判断A7Ct值-A5Ct值，满足条件后则使用A2孔Ct值作为结果；若两个反应孔YZ指数均≥2.00，则反应无效。（反应结果为阳性时也可酌情判定为阳性）

（2） 核酸提取过程控制（A8-B4）

GB 4789.42-2016 诺如病毒检验 核酸提取过程控制示例

规则：若核酸提取效率≥1%，则核酸提取有效。若提取效率<1%，则需重新检测（反应结果为阳性时也可酌情判定为阳性）

方法：通过B1-B4孔建立标准曲线（PC2浓度为1）。核酸提取效率=A8孔Ct值对应的浓度×100%。

4、实时荧光PCR法诊断试验的评价指标

（1）真实性评价

①：灵敏度：也称真阳性率，即实际有病且按该诊断试验被正确地判为有病的概率。

②：特异性：也称真阴性率，即实际无病按该诊断试验被正确地判为无病的概率。

③：假阴性率：也称真阳性率，即实际有病但根据该诊断试验被定为非病者的概率。

④：假阳性率：即实际无病但根据该诊断试验被定为有病的概率。

 （2）可靠性评价

①：变异系数：当做定量试验时，可用变异系数来表示可靠性，即所测平均数的标准差与测定的均数之比。

②：符合率：指同一批研究对象两次诊断结果均为阳性与均为阴性的人数之和占所有进行诊断试验人数的比率。

荧光分光光度计测定什么指标？

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成为分子生物学研究不可或缺的一种技术手段，常见应用于基因表达分析、肿瘤疾病诊断、病原微生物检测、食品安全分析和动植物育种等。qPCR检测技术由于具有高灵敏度的特性，应尽量避免操作中的实验误差，确保获得可靠真实的数据。那么如何确保实验数据的可靠性和真实性，则需要通过对qPCR关键数据的评估来进行判断。除此之外，如何分析qPCR异常数据，也是每一位qPCR实验者需要经历的必要环节。

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实时荧光定量PCR数据中的基本概念：

在整个扩增过程中会出现基线期，指数期，线性期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长，但是在基线期我们没办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的CT值就成了计算模板含量的关键值。

▲ 图一：线性图谱

▲ 图二：对数图谱

为什么知道CT值就能够得到最初的目标基因含量呢？

如图三，表示一个基因单次扩增曲线。N为扩增产物的分子数，模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物的分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此PCR理论方程只在指数期成立，也就是图三绿色框的部分。

▲ 图三

数据处理：

以下三张图分别表示我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线、标准曲线、溶解曲线。

1、juedui定量：使用一系列稀释的已知浓度的标准品与未知样本同时进行测定，根据系列浓度标准品的CT值与起始模板量之间的线性比例关系。

注意事项：

☑  标准品必须来源可靠，浓度已知。

☑  标准品要和待测样品同时在仪器中扩增。

☑  只能根据标准品覆盖的浓度范围进行待测样本浓度的推测。

2、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品之间的表达差异或目标在不同时相差的表达差异，也就是倍数差异。

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