1、为什么实时荧光PCR法要用质控
由于在样本处理、核酸提取、PCR扩增整个过程中存在试剂/设备不稳定、核酸提取效率低、样本交叉污染等问题,所以需要设置质控体系监控核酸提取和PCR扩增全过程。质控体系可以降低实验误差,保证样本检测的准确性,同时避免检测过程中的假阴性和假阳性。
2、质控体系质控品的组成
阳性对照(PC):监控系统故障,一般为含目的成分或片段的质粒。
阴性对照(NC):监控反应体系污染情况,一般为不含目的成分或片段的质粒。
无模板对照(NTC):监控反应体系污染情况,一般为去离子水。
内标(内参):校准生物学误差,判断核酸提取有效性及扩增效率。
重复实验:降低其余误差,一般为2-3次以上。
GB∕T38164-2019 动物源性成分检测方法质控品设置示例
动物源性检测操作中对内参基因18SrRNA进行检测的方法可在第二通道中进行设置。单通道产品则可在B槽中进行,设置同A槽。
3、质控体系设置要求及过程控制
一般无特殊要求的实验需要设置阴阳性对照,如非洲猪瘟病毒检测(TCVMA 5-2018),食源性致病菌检测等(SNT1870-2016),要求严格的实验还需设置内参并进行2-3个平行实验,如动物源性检测(GB∕T38164-2019),转基因定量实验等(GBT19495.5-2018)。
对于涉及人体样本的临床诊断而言,除质控品设置外,还需对整个核酸提取和PCR扩增过程进行质量控制。如诺如病毒检测(GB 4789.42-2016),新冠病毒检测等。
在实际实验过程中,需综合考虑实验环境、操作流程、实验成本等实际条件,以便选择适宜的方法进行质量控制。
(1)扩增控制示例(A5-A7)
GB 4789.42-2016 诺如病毒检验 扩增控制示例
规则:YZ指数<2.00,扩增实验成立,反之,则反应无效。
方法:YZ指数=A6Ct值-A5Ct值,满足条件,则使用A1孔Ct值作为结果;若不满足,则判断A7Ct值-A5Ct值,满足条件后则使用A2孔Ct值作为结果;若两个反应孔YZ指数均≥2.00,则反应无效。(反应结果为阳性时也可酌情判定为阳性)
(2) 核酸提取过程控制(A8-B4)
GB 4789.42-2016 诺如病毒检验 核酸提取过程控制示例
规则:若核酸提取效率≥1%,则核酸提取有效。若提取效率<1%,则需重新检测(反应结果为阳性时也可酌情判定为阳性)
方法:通过B1-B4孔建立标准曲线(PC2浓度为1)。核酸提取效率=A8孔Ct值对应的浓度×100%。
4、实时荧光PCR法诊断试验的评价指标
(1)真实性评价
①:灵敏度:也称真阳性率,即实际有病且按该诊断试验被正确地判为有病的概率。
②:特异性:也称真阴性率,即实际无病按该诊断试验被正确地判为无病的概率。
③:假阴性率:也称真阳性率,即实际有病但根据该诊断试验被定为非病者的概率。
④:假阳性率:即实际无病但根据该诊断试验被定为有病的概率。
(2)可靠性评价
①:变异系数:当做定量试验时,可用变异系数来表示可靠性,即所测平均数的标准差与测定的均数之比。
②:符合率:指同一批研究对象两次诊断结果均为阳性与均为阴性的人数之和占所有进行诊断试验人数的比率。
新型冠状病毒(2019-nCoV)的出现改变了我们的生活、工
1953年,科学家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克发现了DNA分子的双螺旋结构,遗传学的研究进入到分子层次,人
倒置荧光显微镜MF52-N应用于细胞几年来科学家正在开发细胞疗法,希望能治多种疾病和疑难杂症。这就需要质量控
荧光显微镜的荧光染色背景太强如何解决|应用百科荧光显微镜相比普通光学显微镜有高特异性、高灵敏度等优势,是现代
PCR核酸检测试剂中常用的荧光染料,如RTGreen、SYBR Green、EvaGreen等,其核心原料
荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,以此实现对初
1.安装荧光模块后观察,视野不完整,部分区域没有光照解决办法:检查模块上激发块及挡光板拉杆有没有推到位;模块
前言微波消解仪作为样品前处理仪器,需要和后续测试仪器相互配合,才能达到预期的实验目标。原子荧光光度计是常见的
自20世纪80年代,郭小伟教授带领他的课题组完成氢化法原子荧光光度计的研
随着科技的发展,检测技术得到发展,一些检测方法也发生了改变。例如聚氯化铝喷雾干燥稳定性好,水解速度快,吸附能