文献速读 | 新型水凝胶搭载抗炎药物与生长因子，加速SCI创口愈合，促进轴突再生

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是对脊髓造成的暂时性或永  久性的功能性损伤，常见的症状包括肌肉、感觉或自主神经功能的丧失。

在严重的SCI后，神经炎症失调会导致神经元和神经胶质细胞凋亡，在伤口愈合过程中形成疤痕和空腔，并最终形成抑制神经再生的萎缩性微环境。由于涉及到复杂和动态的病理生理学情况，少有通过微环境重塑实现无疤痕和无腔伤口愈合从而促进神经再生的系统解决方案。2021年7月10号，来自于浙江大学医学院的研究团队。在Advanced Healthcare Materials上发表了题为Rationally Designed, Self-Assembling, Multifunctional Hydrogel Depot Repairs Severe Spinal Cord Injury的文章，研究团队研发了一种新型水凝胶，搭载抗炎药物MPSS和GFs，促进瘢痕边缘和空腔愈合，可显著促进轴突再生。

▲论文图

研究结果分析

01首先，研究团队设计并制作了水凝胶

为了填补SCI后不规则的病变区域，研究团队设计了一种可注射、可搭载各种治疗剂的自组装凝胶（HD）。该水凝胶具有亲水性、蛋白粘性以及增加细胞间的相互作用等特性。测定水凝胶冻干样品在2个月内质量损失，结果发现在SCI慢性期后注射该水凝胶可支持细胞迁移。同时，溶胀研究结果发现，该水凝胶适合注射到SCI部位，不会引起注射后的二次损伤。

▲Fig. 1.1

02抗炎药物与生长因子释放曲线的优化

为了改善SCI急性期产生的炎症，研究人员将抗炎药物MPSS包埋进纳米颗粒（NPs）中，将药物释放时间延长至几天，保证抗炎药物在急性期内发挥最大功效。结果显示，传统没有纳米颗粒材料搭载的情况下，MPSS释放时间约为2天；而有纳米颗粒材料搭载的MPSS释放时间长达4-7天，可覆盖SCI急性期。

利用点击化学方式将生长因子(GFs)缀合到水凝胶中，释放时间可长达1个月，在SCI慢性期可为神经再生提供有力的支持。评估生物相容性的结果显示，在水凝胶培养基中培养的细胞与在常规培养基中培养的细胞活力相当，表明水凝胶具有生物相容性，细胞毒性低。

03仅使用生长因子的水凝胶不足以完全防止空腔和瘢痕边界形成

生长因子如BDNF，可显著提高SCI后神经元的存活率，研究团队进一步探究了水凝胶仅缓释生长因子是否会优化神经元/组织的保护效果。首先，使用RWD 68099II 打击器，对大鼠T10节段采用打击速度2m/s，深度2 mm，停留时间为5 s的打击方案来模拟临床SCI 。SCI损伤后的大鼠BBB评分为 0 到 2，说明几乎无轴突存活。

实验组（G-HD）在SCI一周后的损伤部位注入搭载BDNF、VEGF以及bFGF的水凝胶，对照组注入PBS溶液。8周后，3D图像量化结果显示 G-HD 组的空腔体积约为对照组的一半，不规则病理组织的体积增加了一倍，残余组织量相比对照组也显著增加。然而G-HD组在宿主/材料界面处仍然形成GFAP+“墙”，可能是因为 G-HD 组并没有减轻脊髓炎症反应。即单独使用水凝胶长期释放生长因子可以支持神经元/组织存活，但不能完全防止空腔和瘢痕边界形成。

▲Fig. 2

04搭载抗炎药的水凝胶几乎可以完全防止空腔形成，但无法抑制瘢痕的形成

由于生长因子无法有效阻碍空腔形成，研究团队尝试通过延长抗炎药物释放时间，缓解脊髓炎症反应，从而防止空腔形成。将MPSS（M-HD组）和纳米颗粒搭载的MPSS（MP-HD组）分组注射在患处。对比发现，MP-HD组的空腔体积仅为M-HD组的1/7，MP-HD组几乎可以阻止空腔形成。损伤处下方的NF+ 轴突密度是对照组的两倍。由于 MP-HD 组几乎可以完全防止 SCI 后空腔形成，通过评估空腔的体积和剩余轴突的数量来确定介导过度活跃的神经炎症以防止空洞形成的最佳时间窗口。结果表明SCI 后 3-7 天可能是调节失调的神经炎症和保护神经元/组织的最佳时间窗口。

▲Fig. 3

05水凝胶协同释放生长因子和抗炎药物，促进神经再生

尽管 MP-HD 组几乎完全阻止了空洞的形成，但疤痕边界仍然抑制了受损轴突的再生。研究团队推测，除了抗炎药外，提供神经营养因子可能会促进神经元/组织的存活并减弱瘢痕的形成。在损伤后第 7 天，将含有MPSS装载的NPs和GFs的水凝胶（MPG-HD）注射到损伤部位。与 MP-HD 组相比，MPG-HD组几乎完全阻止了空腔的形成并保护了大量幸存的组织/轴突免受二次损伤，致密的GFAP+“墙”在MPG-HD介入后基本消失，新生一些较松散的结构，可能是因为生长材料促进了细胞存活并增强了材料和宿主组织的整合。MPG-HD组伸入病灶 2 mm 的 NF+ 轴突数量增加了两倍但这些轴突并没有延伸到损伤部位的中心。总的来说，MPG-HD治疗挽救了一些幸存的轴突免于继发性损伤，并为轴突再生建立了一个可能的环境，即使这些轴突没有穿过损伤部位。

▲Fig. 4

06MPG-HD 治疗通过 ECM 重塑促进神经再生

研究团队进一步探究了MPG-HD防止空腔/瘢痕边界形成并促进神经再生的机制。

横向脊髓切片的 GFAP 和纤连蛋白 (FN) 染色表明，PBS对照组动物中形成的空腔大部分被 FN+ 基质填充。MP-HD 和 MPG-HD组的脊髓中的 Iba1 和 CD68 免疫反应强度显著降低至与完整组织相当的水平，表明 MP-HD 和 MPG-HD 成功将炎症诱导的神经毒性调节至正常水平。仅在 MP-HD 或 MPG-HD 治疗后在损伤中心区域观察到更多的神经元和髓鞘，表明 MP-HD 和 MPG-HD 治疗后防止了轴突切断的脊髓神经元和少突胶质细胞的死亡。在MPG-HD 组中神经元、成纤维细胞、少突胶质细胞和内皮细胞的比例有所增加，表明 MPG-HD 有助于组织保护和 ECM 形成；另一方面，炎症相关细胞的比例有所减少，表明 MPSS 的释放可以抑制 SCI 后的神经炎症；同时，负责在受伤和完整组织之间形成屏障的小胶质细胞的比例呈下降趋势。

研究人员进一步关注了在SCI伤口愈合过程中发挥抗炎和促炎作用的巨噬细胞，MP-HD 和 MPG-HD注射后抗炎巨噬细胞比促炎巨噬细胞多，且在MPG-HD注射条件下抗炎基因表达增加，促炎基因表达下降。此外，与伤口愈合、髓鞘、ECM、胶原蛋白和 GF 结合以及细胞粘附相关的基因表达在MPG-HD组比PBS对照组中显著富集。这些结果表明MPG-HD治疗优化了ECM形成并促进组织保护。

Fig. 5

07水凝胶通过治疗幸存轴突而非再生轴突来促进功能恢复

在功能和行为方面，第5 周时，G-HD 组大鼠可见明显的踝关节运动，并在注射9 周后达到功能平台。MP-HD 组7周后大鼠可见足底踏地和负重步行，表明 MP-HD 治疗具有防止空腔形成和保护备用幸存组织/轴突的能力。然而，与 MP-HD相比，MPG-HD 治疗未能进一步改善功能恢复，表明 MPG-HD 治疗诱导的再生轴突不能自发发挥功能。

08残留的轴突支配损伤部位下方的脊髓并介导功能恢复

为了确认残余的轴突重新支配了损伤部位下方的脊髓神经回路，使用肌电图 (EMG)评估从中 枢神经元到外周神经元的连接。将刺激电极放置在后肢运动控制区的皮质上，并监测踝屈肌的EMG活动，发现仅在 MPG-HD 组的动物中观察到踝屈肌的EMG 活动，但幅度小于未损伤动物的幅度。为了进一步确认功能恢复是否依赖于残留的神经元回路，研究人员将脊髓损伤部位重复横断，一周后后肢功能改善完全消失，该结果表明，功能恢复是由剩余的轴突依赖性神经元回路介导的。

展望

在本研究中，再生轴突不能穿过病变部位到达运动功能束。理想情况下，具有精确线性阵列的自组装支架可以帮助轴突经由脊髓病变部位向适当的目标区域再生，但是目前还没有这种技术。在未来的研究中，原位 3D 打印技术可能能够在脊髓病变上创建精确、高保真的线性阵列。即使损伤的轴突可以在病变处生长，它们可能仍然难以触及靶点，并且它们可能需要依赖于使用可塑性来形成中继电路并整合到功能网络中。

瑞沃德68099II精密打击器是一款用于颅脑和脊髓损伤造模的仪器，采用气动-电动控制，可精 准调节打击速度、打击深度以及停留时间，实现精 准打击。

* 戳这里查看文献原文https://img03.en25.com/Web/RWD/%7B263c58db-a399-4dd3-8957-90237686bbb3%7D_Depot_Repairs_Severe_Spinal_Cord_Injury.pdf

文献速读第12期

Neuron：编码尼古丁厌恶反应的神经环路机制

尼古 丁成瘾的一个重要假设是尼古丁“劫持”了大脑中的奖赏系统。然而，动物对尼古 丁的反应呈现剂量依赖性：在低剂量时，动物表现为奖赏行为，而在高剂量时，动物则会产生强烈的厌恶反应。与其它成瘾物质不同，尼古丁是唯 一被观察到在啮齿类动物中能够引起厌恶反应的药物。然而，对于已知的调节奖赏和厌恶情绪的多巴胺回路是否构成了尼古丁剂量依赖效应的基础目前仍不确定。

2022年8月1日，美国加州大学欧文分校的研究人员在《Neuron》期刊上发表题为 “An inhibitory brainstem input to dopamine neurons encodes nicotine aversion”的文章。该研究揭示了多巴胺神经元的抑制性脑干输入编码尼古 丁介导厌恶信息，从神经环路水平揭示了尼古丁剂量依赖性的奖赏和厌恶作用。在文章中，作者证实高剂量的尼古 丁会诱导小鼠的厌恶相关行为，引起腹侧被盖区多巴胺神经元双向反应，这些神经元分别投射到伏隔核外侧和内侧亚区。尼 古丁的剂量反应依赖于α4β2和α7尼 古丁受体。外背侧被盖区中GABA神经元上α7受体激活是外侧伏隔核中多巴胺释放减少的关键调节因子，抑制外背侧被盖区中GABA神经元末梢可预防尼-古丁厌恶反应。该研究阐述了一个尼古 丁厌恶反应神经环路，这可能是未来尼古 丁成瘾治疗的有效方法。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.07.003

Science Advances：D1-MSNs亚型可负向调节可卡-因成瘾行为

纹状体在调节成瘾相关行为中起着关键作用。传统的二分模型显示纹状体D1/D2中型多棘神经元（Medium Spiny Neurons, MSNs）能够正向/负向调节成瘾相关行为。然而，该模型并不能解释纹状体神经元的异质性和功能多样性，而且在D1/D2群体之外的MSN亚型是否在药物成瘾中发挥着独特的作用仍然是未知的。

2022年8月12日，美国波士顿儿童医院的研究人员在《Science Advances》杂志上发表题为“A molecularly defined D1 medium spiny neuron subtype negatively regulates cocaine addiction”的文章。通过使用可卡-因成瘾小鼠模型，作者确定了表达速激素2（Tac2+）的D1-MSNs亚型神经元在可卡-因成瘾中的作用，该亚型存在于啮齿动物和灵长类动物的纹状体中。作者发现，急性给予可卡-因会降低Tac2+神经元的活性，而可卡-因调节会改变与可卡-因奖励相关的神经元反应。此外，Tac2+神经元的激活/抑制可减弱/促进可卡-因诱导的条件性位置偏好和可卡-因静脉注射自主给药。此外，刺激伏隔核-下丘脑外侧环路中的Tac2+神经元的可抑制可卡-因奖励行为。该研究揭示了D1-MSNs在药物成瘾中的非常规负调控功能，该功能以细胞亚型和投射特异性的方式运作。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn3552

Science Advances：星形胶质细胞NMDA受体可维持可卡-因记忆

从奖赏到成瘾是一个多层面和相互关联的行为序列，涉及大脑多个区域、不同细胞类型以及信号通路。最近的研究表明，星形胶质细胞参与突触传递、突触可塑性、突触形成、维持和消除，并且在奖赏行为中的神经可塑性中也发挥了作用。此外，星形胶质细胞也表达n -甲基- d -天冬氨酸（N-methyl- d -aspartate, NMDA）受体，但其在成瘾行为中的作用尚不清楚。

2022年7月22日，美国克莱顿大学的研究人员在《Science Advances》杂志上发表题为“Cocaine preference and neuroadaptations are maintained by astrocytic NMDA receptors in the nucleus accumbens”的文章，该研究探讨了星形胶质细胞NMDA受体在药物诱导的行为和可塑性中的潜在作用。作者发现，星形胶质细胞的NMDA受体是维持可卡-因偏好记忆的关键，清除伏隔核星形胶质细胞的NMDA受体有助于消除可卡-因诱导的条件性位置偏好。此外，作者发现伏隔核星形胶质细胞NMDA受体由GluN2C亚基组成，可卡-因会增加GluN2C的表达，这对可卡-因记忆的维持至关重要，GluN2C敲除小鼠的可卡-因记忆消退增强证明了这一点。此外，星形胶质细胞NMDA受体和GluN2C亚基通过调节突触源性因子的表达，在可卡-因诱导的树突棘和突触可塑性中起关键作用。总之，这些结果确定了一种以前未知的星形胶质细胞NMDA受体机制，该机制可以维持可卡-因的记忆。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo6574

Cell Reports：多巴胺通过KCNQ通道磷酸化来驱动奖赏行为

多巴胺神经元能够调节记忆和学习、运动功能、以及动机和奖励的情绪行为。功能失调的多巴胺信号涉及各种神经心理障碍，包括帕金森病、药物成瘾和精神分裂症等。纹状体/伏隔核中表达多巴胺D1受体（D1R）的中型多棘神经元（Medium Spiny Neurons, MSNs）受多巴胺和谷氨酸的双重控制，在奖赏行为中起着关键作用。多巴胺似乎增加了D1R-MSNs的兴奋性，进而促进谷氨酸诱导的放电，并导致奖励行为。然而，多巴胺促进MSN兴奋能力的分子机制仍有待研究。

2022年9月6日，日本藤田保健卫生大学的研究人员在《Cell Reports》杂志上发表题为“Dopamine drives neuronal excitability via KCNQ channel phosphorylation for reward behavior”的文章。该研究证实，D1R激动剂SKF81297抑制KCNQ介导的电流，并增加小鼠伏隔核切片中D1R-MSNs的放电频率，而这一现象被ERK信号抑制所消除。激活D1R/PKA/ERK信号通路增加了KCNQ2的磷酸化。D1R-MSNs中条件缺失KCNQ2可降低SKF81297对KCNQ通道活性的抑制作用，同时增强神经元兴奋性和可卡-因诱导的奖励行为。这些效应可在野生型而非KCNQ2磷酸化缺失的表型中得到恢复。因此，D1R-ERK信号可以通过KCNQ2磷酸化来控制MSNs的兴奋性，从而调节奖赏行为。这些结果提示KCNQ2可以作为奖赏环路失调相关精神疾病的潜在治疗靶点。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111309

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一、简介

       LUV－II(新型) 紫外加速老化试验箱是在LUV－I紫外加速老化试验箱的基础上新开发的微机型产品,其技术参数完全符合国家标准GB/T1865-2009;ISO11341:2004«色漆和清漆 人工气候老化和人工辐射曝露» 、ISO4892«塑料--实验室光源暴露方法» 、 ASTM D3451«涂料粉末和粉末涂料的测试» 、ASTM D3794«卷材涂料的测试» 。本仪器采用LCD液晶显示器，显示直观、操作简单，取代了(老款)LUV－II仪表的繁琐操作；采用高精度数字温度传感器和利用PID调节使得温控精度大大提高；并且还增加了时间记忆功能，避免了因试验过程突然断电，致使试验重新开始。

二、产品概述

       本装置适用于通过光水曝露加速老化试验，预测油漆 、涂料、塑料等金属材料的相对耐久性，尤其适合观察特别耐用材料的物理性能破坏，如光泽降低、雾影、强度降低、粉化、开裂、起泡、脆化和褪色等。

    同其它实验室加速试验一样，不能利用本装置的试验结果替代天然曝晒来判定材料的实际耐久年限，但本装置提供的对比试验条件，对快速评估材料的抗老化性能、筛选或改进新老配方、监控产品质量是相对实用的。  

       由于紫外光是造成户外产品耐用度下降的主要光照因素，加上荧光灯管相对稳定的光谱能量分布和低廉的价格，紫外光老化试验箱以快捷、便利和经济的优势成为世界上目前使用Z为广泛的耐候测试机种。本装置作为简易机型，特别适合经济条件有限的实验室选用。

      本装置采用的旋转样板架设计可以很好地补偿由于灯管老化和各批次差异等诸多因素带来的光辐射不均匀缺陷，省却了一般仪器需定期按顺序互换样板位置的繁重工作量。

       由于水分是加速老化的重要破坏因素，本装置采用水喷淋方式模拟湿气的影响。通过对喷淋时间的设定，可以比较接近某些Z终使用的环境条件，如温度剧变或雨水冲刷所造成的机械侵蚀等。

       为满足耐候测试机坚固耐用的使用要求，本装置结构件普遍采用了耐蚀不锈钢材料。设计上力求结构简单、便于使用和维修。

       只需付出相对低廉的使用成本，就可使您在短时间内了解自然条件下长时间才能形成的材料损害，判定试验产品与对照样板之间的品质差距。

       根据标准GB/T1865-2009;ISO11341:2004«色漆和清漆 人工气候老化和人工辐射曝露»规定，人工气候老化过程中试验箱温度应控制在38±3oC；相对湿度为40%～60%中进行人工气候老化试验。

三、主要技术参数

       1、总功率：                         1.25kw

       2、电源：                           AC220V/50Hz

       3、试验时间定时范围：               1s~999h59min59s

       4、喷淋时间定时范围（双设定）：      1s~99h59min59s

       5、试验温度设定范围：      38±3oC

       6、紫外光峰值公称波长（光量子能量） 313nm(91.5kcal/gmol)

       7、紫外荧光灯管功率：               0.02kw×3

       8、灯管额定寿命：                   1600h

       9、灯管对转架轴线分布直径：         80mm

       10、灯管壁至试样Z近距离：          28～61mm

       11、试样转架回转直径：              Ø 189～Ø 249 mm

       12、试样转架传动电机功率：          0.025kw

       13、传动电机转速：                  1250r.p.m

       14、试样转架转速：                  3.7cp.m

       15、水泵功率：                      0.08kw

       16、水泵流量：                      47L/min

       17、电热管功率：             1.0kw

       18、试样规格：                      75mm×150mm×(0.6)mm

       19、试验箱外形尺寸（D×W×H）：    395（385）×895×550mm

       20、重量：                          63kg

(以上个别参数有调整的可能)            

四、 试验前准备工作

       1、试验箱应稳固安放在远离强气流、强磁场干扰的平整场地。

       2、试验箱体应可靠接地。

       3、仔细清除试验区域的尘埃、锈蚀、污物和残留水渍。

       4、打开仓门、向试验箱底注入去离子水，水的电导率＜5us/cm,水中固溶物＜1ppm,二氧化硅＜0.1ppm,水面应贴近沥水栅板。(尽量一次性加足试验所需用水，这样可以避免多次加水时温度降低，以至于影响试验精度。)

5、准备与试样有类似组成和结构、并且规格相同的对照样板，对照样板通过标准的户外曝露试验或其它方式确知其性能。理想情况下其破坏模式与受试材料一种有相对好的耐久性而另一种有相对差的耐久性。为保证试验结果的统计评定，各种试样和对照样板应置备一式数份重复样。

6、往试样转架上安装试样和对照样板，做到夹持可靠、分布对称。建议在空缺位置装满空白样板，保持一致的试验条件。

7、关闭并可靠锁止仓门。

五、键盘说明

      老化箱控制器总共有六个键，数字键“↑”、移位键“→”、“设定”键、“清零”键、“运行/停止”键、“确定”键。

六、操作步骤       

       1、打开“电源”，这时LCD液晶显示“欢迎使用LUV－II老化箱，服务电话021-52821266”持续3秒之后进入主菜单。                                                                                                                                          2、参数设定(仪器停止状态下操作有效)

     ①定时时间设定：按“设定” 键，LCD液晶进入参数设定选择菜单，这时“▼”指向“定时时间设定”并闪烁，按“确定”键进入定时时间设定菜单，此时定时时间设定“时”的Z高位闪烁，表示该位被激活，按数字“↑”键可改变所需要设定的数值，通过移位“→”键和数字“↑”键，设置所需的定时时间，按“确定”键将定时设定值存入计算机内存，此时LCD液晶回到主菜单。

      ②喷淋时间设定：按“设定” 键，LCD液晶进入参数设定选择菜单，这时“▼”指向“定时时间设定”并闪烁，通过按移位“→”键使 “▼”指向“喷淋时间设定” ，按“确定”键进入喷淋时间设定菜单，此时喷水设定时间“时”的Z高位闪烁，表示该位被激活，按数字“↑”键可改变所需要设定的数值，通过移位“→”键和数字“↑”键，设置所需的喷水/停喷时间，按“确定”键将喷淋设定值存入计算机内存，此时LCD液晶回到主菜单。

       ③试验温度设定：按“设定” 键，LCD液晶进入参数设定选择菜单，这时“▼”指向“定时时间设定”并闪烁，通过按移位“→”键使 “▼”指向“试验温度设定” ，按“确定”键进入试验温度设定菜单，此时设定温度的Z高位闪烁，表示该位被激活，按数字“↑”键可改变所需要设定的数值，通过移位“→”键和数字“↑”键，设置所需的试验温度，按“确定”键将温度设定值存入计算机内存，此时LCD液晶回到主菜单。(注：温度只可以在40℃-60℃范围内进行设定)

       ④清零功能：LCD液晶在主菜单并且仪器停止工作状态下按“清零”键，“当前运行时间”闪烁，按“确定”键后，“当前运行时间”归零。若连续两次按“清零”键，将退出清零功能。

       3、功能按钮“定时”、“旋转”、“温控”、“喷淋”，根据试验需要开启相应功能按钮。

       ①“定时”按钮，打开后，按“运行/停止”键，仪器开始工作，达到定时设定时间，仪器停止工作。(注：若未开启“定时”功能，1000小时后仪器将自动停止工作。)

       ②“旋转”按钮，打开后，按“运行/停止”键，试件转架开始匀速转动。

       ③“温控”按钮，打开后，按“运行/停止”键，老化箱内温度达到设定温度值后，开始进入恒温状态。

       ④“喷淋”按钮，打开后，按“运行/停止”键，进入喷淋模式，根据设定的喷水/停喷时间水泵间歇工作。

       (注：①至少要开启1个功能按钮，若功能按钮均未开启及“空载”，按“运行/停止”键时，蜂鸣器将发出“嘀嘀”的警告声。②在定时功能开启的情况下，若当前运行时间≥设定定时时间，按“运行/停止”键时，蜂鸣器将发出“嘀嘀”的警告声并且LCD液晶显示的“当前运行时间”闪烁。)

       4、查询功能

       在仪器运行状态下，按diyi次“设定”键，LCD液晶进入“定时及剩余时间查界面”，按第二次“设定”键，LCD液晶进入“喷水、停喷及剩余时间查询界面”，按第三次“设定”键，LCD液晶进入“设定温度查询界面”，按第四次“设定”键，LCD液晶回到主菜单。(注：①在任一查询界面下按“确定”键LCD液晶均可回到主菜单，②查询状态下按“运行/停止”键无效。)

       5、试验结束时，在确定电源关闭后开仓取件。

       6、排尽箱底存水并彻底清洁试验区域。

七、 注意事项

       1、具有高辐照度水平的UVB光源，虽然能Z大程 度地加速试验进程，但有时也会对某些材料造成甚于天然曝晒的老化破坏，如过度变色。所以在评判与对照样板有差异的试样时，应注意这一因素。

       2、不使用未经检定的非专用灯管。

       3、应配备专职值班人员在试验的全过称中监控老化和安全状态。

       4、必须在关闭电源的前提下打开仓门或更换灯管。                                                                                   5、在没有戴护目镜时，不要用肉眼直接观察点亮的紫外灯。以免皮肤灼伤。

       6、如水位低于临界水位，蜂鸣器将发出“嘀嘀”的报警声并且LCD液晶显示的低水位光标“◆”闪烁，应及时补充去离子水，避免水泵在无水状态下运行。          

       7、试验区域不洁和不使用去离子水都会在试样上生成妨碍观察的水渍，也影响设备元器件的使用寿命。

       8、在整个试验过称中应保证电器箱上的冷却风扇正常运行。

       9、要防止缺乏经验的非专业人员随意更改设定参数。

       10、对照试样宜分别安装于转架的轴对称位置以获得对等的光照条件。

       11、本装置系薄板密集型机构，操作与检修时应注意安全，防止擦伤。

背景

牙周炎是一种较为常见的慢性炎症，常发生于30岁以上的成年人。若不进行及时有效的治 疗，将可能导致严重的牙周损坏，包括牙槽骨、牙周韧带、牙骨质等，并导致牙齿脱落。针对该疾病，目前主流的治 疗方法较多，包括龈下刮治术、根面平整术、翻瓣术等手术方式，也有通过降解膜引导的组织再生法。

  因组织的成分复杂性和牙周缺陷的结构复杂性，组织再生法一直没有显著突破。最近，Arwa Daghrery等科研工作者尝试使用生物3D打印的方式，通过静电纺丝书写这一功能构建支架，促进牙周组织再生。其创新点主要有以下两个：一、验证模拟天然组织的结构和组成可促进组织有效整合这一理论；二、考虑体内免疫应答在组织再生中的作用，调整支架成分。

实验细节及结果

作者使用的主体材料为PCL——一种FDA批准可用于人体的聚合物，可在加热条件下熔融，并可在电场下被拉成极细的纤维，因此可以应用于静电纺丝书写中。使用的设备为放置于生物安全柜中的regenHU生物3D打印机（配备MEW：熔融静电纺丝书写打印头）。将原料颗粒置于料仓中，加热至90℃并维持30 min后，以一定的气压、电压和速度进行打印。

文中提到的实验主要分为两部分：

一、体外实验：考察不同打印条件所得支架的细胞增值情况。作者分别打印出随机（Random）、有序（Aligned）、小孔（Small Spacing，250 μm间距）、大孔（Large Spacing，500 μm间距）四种支架结构（图1），在附着细胞并培养1、3、7天后，分别对细胞成活率进行检测。结果为有序（Aligned）打印模式下的支架效果更好（图2）。

图1 四种打印支架的结构电镜图

图2 培养细胞后的支架分别于1、3、7日获得的细胞成活率

二、体内实验：在大鼠牙槽构建模型，验证模拟天然组织的结构和组成可促进组织有效整合这一理论，阐明纤维形态学、纤维间距、化学组成对牙周组织再生的影响。在这一环节，作者选用的支架纤维形态学为有序（Aligned），因其在之前的结果中效果更佳；而纤维间距尽管在上一环节表现不尽人意，但为了促进组织再生（提供更大的空间以便于细胞增殖），作者参考了其他文献，选用了500 μm的间距；化学组成则为该课题组之前的研究成果，在普通PCL上覆盖氟化磷酸钙（Fluorinated calcium phosphate，F/CaP）使牙槽骨再生更加稳固以支撑牙周韧带的生成；同时，为了防止软组织渗透进入创伤部分阻碍牙周再生，作者也添加了胶原（Collagen）提供临时屏障，抵挡牙龈上皮细胞和纤维原细胞的侵入。因此在对比实验中，共有4组，分别为对照组（Sham）、胶原组（Collagen）、覆盖氟化磷酸钙的有序骨架组（Aligned+F/CaP）、在空隙填充胶原的覆盖氟化磷酸钙有序骨架组（Aligned+F/CaP_COL）。

在植入大鼠牙槽后分别于第3、6周检测骨体积（BV）和骨填充比例（BF），发现Aligned+F/CaP_COL的表现更佳（图3）。

图3 骨体积（BV）和骨填充比例（BF）对比

小结

作者的成果为牙周组织再生提供了新的治 疗思路，但目前仍停留在小型动物实验阶段。未来如果能成功进行大型动物甚至人体实验，将大大提升这一方法的可行性。

参考文献

[1] Arwa D, Jessica A. F, Jinping X, et al. Tissue-specific melt electrowritten polymeric scaffolds for coordinated regeneration of soft and hard periodontal tissues[J]. Bioactive Materials 19 (2023) 268–281.

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近年来USP和ICH都针对分析方法开发与验证进行了修订。USP新收录通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，分别从分析方法开发、分析方法性能确认及分析方法使用三个阶段分别阐述如何在分析方法整个生命周期内对方法进行管理。而ICH Q14分析方法开发和Q2(R2) 分析方法验证的修订也进入到了第三阶段，按照计划其将在2023年5月前完成阶段的定稿。这些信息都表明了分析方法开发和验证的管理将会变得更严谨、更科学。

因为色谱仪器包括色谱-质谱联用技术在药物开发过程中的广泛使用，色谱分析方法的开发与验证也成为了方法开发与验证，乃至分析方法生命周期管理中的重要内容。针对色谱方法开发与验证的整体流程，可以将其大致分为：方法筛选、方法优化、耐用性测试和完整的方法验证这四个阶段。

而这四个阶段都离不开仪器准备、队列运行、数据查看与处理以及报告这几个环节。赛默飞的旗舰版色谱数据系统Chromeleon 软件功能丰富而注重实践，能够帮助实验室的色谱分析实现精简、高效的工作流，以实现更快的样品到结果的转换。

自定义变量的灵活应用

在Chromeleon CDS 中创建队列时可以通过手工填写的传统方式，也可基于事先建好的队列模板。值得一提的是Chromeleon 强大的样品列表功能。除了运行样品的基本信息（样品名称、仪器方法、运行的其他必须参数）之外，还可以通过自定义变量的形式，添加额外的注释信息，例如色谱柱类型、缓冲液名称等用于清晰识别每一针进样的信息。

使用者还可以进一步创建一些自定义变量并将其与仪器方法中的参数进行链接，更加简单地实现实验设计（DoE）的环节。一旦基本方法固定，便可通过改变色谱柱选择阀或溶剂选择阀等参数实现不同要素的组合以寻找具备可行性的色谱条件，也体现了ICH和USP所倡导的“多变量分析方法开发”这一方针。相比传统的样品队列创建方式，减少了所需创建的仪器方法的数量，并以清晰直观的模式展示了所使用的变量以及变量值，结合缩略图功能提供了更直观的信息。

在数据处理阶段，可以再次利用Chromeleon 样品列表中的自定义结果变量功能，可以方便地实现运行样品的同时进行结果计算，例如系统适用性参数的计算，峰面积、含量以及测试是否通过等信息的显示，帮助使用者快速查看所需信息以便灵活调整实验的方向。

完全可定制的

Chromeleon

报告模板也支持自定义变量、公式和计算，使用者可以使用内置的模板，也可以根据需要进行调整，得到包括多个工作表、结果表和图形的报告，无需导出到其他软件，也无需手动计算，从而消除转录错误。所有报告和计算都可以在合规的环境中完成，并在源数据发生变化时自动更新。可以选择在运行结束时自动打印、导出也可以发送电子邮件通知给相关人员。

更便捷的eWorkflow

Chromeleon 也提供一个创建序列、运行并得到结果的简单而直接的方法，这就是eWorkflow。它最 大限度地减少了操作步骤并涵盖了色谱或 MS 工作流程的所有方面，定义了可以在哪些仪器上运行分析以及应该使用哪些方法和文件，包括仪器方法、处理方法、报告和外部文件，例如 SOP。 

与前面提到的自定义变量等有效结合，只需单击几下即可创建复杂的序列并立即运行，并在运行后得到所需的报告。这些都可以减少错误、更快地产生可靠的结果，并且显著减少了培训的需求，有效加速了方法开发的流程。

分析方法验证工具包

ICH指南定义了方法验证应该执行包括专属性、准确度、精密度、检测和定量限度、线性、范围和耐用性的测试。除了样品运行的环节之外，计算、整理和报告验证结果也可能需要很长的时间，而且大多数测试都涉及将结果与指标进行比较，相对比较繁琐。 

在eWorkflow的基础上，Chromeleon 又提供了一个方法验证的高效工具，ICH方法验证扩展包。扩展包内有一系列的模板，每个模板都包含处理方法、报告模板和自定义变量以覆盖所需的变量和参数。所有这些都在 eWorkflow 程序中捆绑在一起，以确保正确执行ICH所要求的相关测试，减少人为错误并加速流程：eWorkflow 可以引导创建队列，自动执行所有计算，并通过报告直接显示通过或失败的结论。

以上介绍的几个工具仅为Chromeleon 强大功能的冰山一角。结合Chromeleon 实用的多厂商仪器控制能力，出色的系统适用性和智能运行控制功能，便捷的数据积分、处理功能，直观的图形化显示，全面的合规能力，Chromeleon不但可以提升方法开发、验证的效率，也一定能够帮助色谱工作者执行分析方法生命周期的管理。