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【打造梦想实验室】类器官实验室——并非普通的细胞实验室

贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司    2022-11-24       浏览 72 次

类器官作为近年来发展迅速的生物技术,逐渐受到科研及医疗工作者的关注。区别于传统的细胞培养模式,类器官通过3D培养的方式,使细胞在发育过程中能够同时发生分化,进而形成具有差异性的细胞结构。除了科学研究,类器官技术目前已逐步应用到临床辅助诊断和药敏药筛检测等方面,应用前景值得期待。


器官 VS 3D培养细胞

从类器官的定义和来源来说,类器官属于3D细胞培养物,它包含器官特异性的细胞类型,同时可以表现出器官的空间组织和复制器官的某些功能。然而类器官与3D培养细胞并不能直接画上等号。即使通过利用分化能力较高的干细胞系或者是癌细胞系进行3D培养,由于细胞系经过人为的传代和驯化,细胞系通过3D培养方式产生的细胞球体往往容易遗失一些原代细胞群具有的特性。因此,使用原代分离的细胞会更容易还原器官细胞群的原始结构和状态。


搭建类器官实验室

搭建类器官实验室,部分可沿用传统细胞实验室的设计。类器官实质上是通过使用特定的介质耗材(比如:Matrigel)进行细胞培养,并加入特定的生长因子使细胞能够在悬浮且稳定的环境下进行增殖与分化。因此,一般的细胞实验室的配置(包括:二氧化碳培养箱、生物安全柜、显微镜等)仍然是主要配置。在实验室的布置上,为了减少室内污染,需要对细胞实验室进行独立分割,设置缓冲间,并设置传递小窗进行样品和试剂的传送。


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此类操作环境需要特别注意清洁与整洁,因此在超净工作台中还需设置明确的操作分区,搭配干净灭菌的设备耗材是最关键的配置要点。在超净工作台中可大致分为洁净区、工作区和废料区;工作区在出风口的前方,主要是我们进行实验操作的区域;洁净区在工作区的左方和前方,用于放置移液器、吸头等耗材,以及放置样本和相关试剂、培养基等耗材;废料区设置在工作区右方,用于放置使用过的吸头、注射器和废液等。


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在这个基础上,需要考虑到类器官的结构与常规培养细胞的不同,类器官往往具有一定的厚度,在成像观察方面是有一定的难度。因此实验室内除了配置常用的倒置显微镜以外,配置具有更清晰的拍摄能力的显微镜会更为重要,有条件的实验室还可考虑配置高通量成像分析系统


基于类器官3D细胞培养的步骤,类器官实验室的相关设备配置及注意事项包含以下方面:


细胞收集

主要设备:离心机、倒置显微镜、冰箱、液氮罐


类器官可以使用活体液体分离细胞或者组织原代分离的细胞等。如常见的肠道类器官,使用的是小肠分离隐窝细胞进行培养。在获得样品后,需要进行前处理操作如下:

(1) 细胞离心沉淀:为了保护细胞的活性,减少操作过程引入的机械磨损,离心的过程需要保证低速离心运作,而且低温离心效果更佳。

(2) 细胞观察与计数:当细胞分离完成后,通过倒置显微镜观察细胞形态并且对目标细胞进行计数。


关键要点:

1. 低温操作与存放细胞,避免细胞活性受损。

2. 注意环境与耗材清洁。


细胞培养

主要设备:二氧化碳培养箱、超净工作台、单按键式移液器、多通道移液器、电动助吸器、涡旋振荡器、金属浴


可选设备:培养基成份分析仪、自动化移液系统


类器官细胞培养过程与传统细胞培养方式不同,需要在稀释细胞悬液后加入融解的Matrigel,并混合均匀以在细胞铺板后形成半固体液滴。另一方面,为了让培养细胞产生分化,形成特定的结构,需要在培养基中加入一定的生长因子辅助。为避免产生细菌污染,细胞的铺板须在超净工作台上工作,并推荐使用单按键式移液器进行操作,避免液体倒吸时进入移液腔管产生交叉污染。同时Matrigel较快凝固,需迅速且均一完成加样,保证每孔的细胞水平基本一致。二氧化碳培养箱需定期进行清洁,推荐具备干热消毒功能的一体化腔体设计培养箱。


关键要点:

1. 在Matrigel混合细胞悬液移液的过程,需要保证移液迅速而且液滴均一。

2. 使用合适的生长因子与培养基进行类器官培养实验。

3. 注意培养的条件,同时注意培养箱的日常清洁,避免反复打开培养箱。

4. 培养基的成份对于类器官的生长以及对于药筛实验会产生影响,有条件的实验室可考虑通过培养基成份分析仪器或者使用液相色谱串联质谱进行成份分析。


类器官观察与检测

主要设备:高内涵成像分析系统、共聚焦显微镜、倒置显微镜


可选设备:流式细胞仪


类器官的观察是3D培养关键的一步,通过清晰的成像有助于观察培养的效果。宽场显微镜往往因类器官具有一定的厚度而使成像效果不佳,类器官形态偏暗而且只能够看到大致轮廓和大小。因此类器官观察更多使用荧光显微成像的方式,多色的成像也可用于区分不同的细胞标志物,从而观察类器官的细胞分化状态。此时为了避免产生重影干扰,使用共聚焦显微镜更易于观察到胞内结构。另一方面,对于一块细胞板上多孔类器官的观察,具有高通量扫描的成像分析系统使类器官的观察更为简单。


类器官应用与分析

主要设备:移液器、PCR仪、金属浴、真空浓缩仪、片段分析仪、超声片段仪、电子天平、离心机、液相色谱串联质谱、高分辨质谱、二代测序仪及建库试剂、CRISPR/Cas基因编辑系统


功能性研究:研究特定基因对类器官的细胞分裂与分化产生的影响,常见的研究包括:基因组/转录组学研究,研究细胞形成器官结构过程中的细胞分化内在机制,细胞分群分析等;代谢组与脂质组学方面的研究,药筛研究相关实验除了从类器官的形态变化中判断药效,也需要通过收集细胞培养液进行分析,从中获得蛋白质与代谢物的变化情况,进一步判断药物机制与用药进展监控。


关键要点:

1. 对于转录组分析,细胞的活性往往影响了RNA的完整性,因此在RNA提取步骤的过程中需注意环境清洁。部分操作过程,比如离心操作,需注意配置温控功能的离心机进行低温离心。

2. 对于代谢组与脂质组分析,类器官会产生较多的外细胞基质,因此需要通过一定的前处理并搭配合适的液相色谱进行纯化才可以进一步分析。


丹纳赫生命科学关注类器官的研究,提供各类先进设备以及整合的解决方案。


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丹纳赫生命科学提供类器官研究的相关工具,从类器官模型搭建、成像分析到组学研究方面为科研工作者提供帮助。尤其在药筛研究和成像分析过程中,其具有优势的产品设备能够促进研究进程,提供精 准分析。


在转化医学应用方面,肿瘤治 疗是类器官的应用方向之一。通过分离患者的癌细胞,诱导分化培养类器官,然后进行相应的用药处理,能够有效模拟药物对肿瘤组织的影响。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特的Echo移液工作站的精确移液是进行药筛实验的得力助手。Echo系列纳升级声波移液工作站,拥有小体积声波移液黑科技,能够精 准移取2.5nl到25nl微量液滴流;根据不断变化的液体类型、体积或性质进行实时调节,无需用户干预;可重复移取复杂的试剂组合或性质不一致的试剂。


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贝克曼库尔特Echo系列纳升级声波移液工作站


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丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器的智能型共聚焦高内涵成像与分析平台,在药效鉴定、药毒性筛查和科学研究中提供各种类型类器官模型高通量成像与3D分析。ImageXpress Confocal HT.ai智能型共聚焦高内涵成像与分析平台包含如下特点:优质3D成像系统,配有7激光8通道光源、转盘共聚焦系统、自动化水镜等,提供快速的高分辨成像;专业3D分析及AI软件MetaXpress和IN Carta;专业自动聚焦系统,适用于孔板、玻片及商业化和自制类器官等各类板材。


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MD ImageXpress Confocal HT.ai

智能型共聚焦高内涵成像与分析平台


专业的显微镜设置与操作往往需要较强的专业背景与经验。对于初学者,如果对多种不同的成像技术都有应用需求,使用多功能的显微成像模组会更友好。丹纳赫生命科学旗下徕卡显微系统的MICA 多模态显微成像中 枢,集多功能于一身。它具有以下特点:快速设置,简易成像,对实验新手友好;宽场、共聚焦、Lighting检测模式快速切换,满足不同检测精细度及应用目的需要;多荧光指标同时检测,接近无延迟的成像效果;可在MICA系统中直接培养并观察细胞。


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Leica MICA 多模态显微成像中 枢


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