【白皮书下载】术中OCT辅助基因治 疗（英）

术中OCT提高视网膜下基因增强治 疗的手术安全性和治 疗准确性

基因增强治 疗是一种眼部基因转移方法，用于治 疗当功能蛋白不足表现为遗传病时的常染色体隐性或X性染色体连锁视网膜营养不良。这些基因缺陷引发特定视力障碍和/或视网膜变性。

近期，基因治 疗在视网膜营养不良中的应用引发了人们巨大的兴趣。视网膜下基因治 疗药物注射术的技术要求较高，具有一定难度。术中光学相干断层扫描（术中OCT）可提供实时信息并向外科医生提供反馈，包括对眼后段结构的渗透深度、注射液的分布和传播、载体回流以及术中黄斑中心凹的完整性。

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术中光学相干断层扫描（OCT）辅助下Leber先天性黑矇（LCA）黄斑修复术

病例研究的内容

Leber先天性黑矇（LCA）是一组先天性视网膜营养不良，可导致早年出现重度视力损伤。患者通常表现为眼球震颤、瞳孔反应迟钝或近乎缺失、视力严重下降、畏光和高度远视[1]。眼部基因治 疗可极大改善这些患者的视力[2]。通过术中视网膜下注射AAV载体完成基因传递。

视网膜下眼部基因治 疗注射对准确度水平有较高要求。因此，术中光学相干断层扫描（OCT）是一项必不可少的工具。术中OCT可向眼科医生提供实时信息，支持气泡管理，并可用于确认预期的载体量是否到达视网膜下间隙。术中OCT还有助于预防并发症，例如载体注射期间术中形成的黄斑裂孔。

病例研究中值得期待的内容

学习要点

• 了解21岁视网膜变性及2型Leber先天性黑矇（LCA）患者的手术治 疗

• 发现视网膜下眼部基因治 疗注射的不同步骤

• 理解术中OCT在黄斑修复术中的作用

眼部基因治 疗病例描述

1例21岁西班牙裔女性，自出生以来视力不良，包括夜盲症、视野收缩、视力下降和色觉下降。患者注意到出现缓慢的进行性功能性退减。尽管已完成高中学业，但她的方向感日益恶化，并且由于视力限制无法独立生活和工作。

图1：图注：黄斑OCT和超宽视野眼底图像显示基线色素性视网膜病变和相对保留中央凹的感光器改变。图像由A博士提供

诊断与术前评估

双眼术前视力均为20/150。患者表现为典型弥散性视网膜变性，黄斑相对保留。基因检测显示双等位基因RPE65变异导致视网膜变性，并提示2型Leber先天性黑矇。鉴于可获得视网膜活细胞且考虑到眼部基因治 疗的潜在受益，对双眼进行了视网膜下注射治 疗。两次手术之间间隔两周。黄斑OCT和超宽视野眼底图像显示基线色素性视网膜病变和相对保留中央凹的感光器改变。

图2：进行黄斑扫描以记录注射前解剖结构，图像由A博士提供

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来自视网膜、玻璃体和黄斑疾病治疗医师A博士的经验：

采访中，A博士详细讲述了自己使用带有内置术中OCT的眼科显微镜经验。他表示，眼科显微镜在糖尿病患者治疗中是一种非常有用的工具。使用内置OCT的眼科显微镜，可以可视化黄斑，了解是否存在黄斑裂孔、视网膜前膜和其它可能存在于视网膜表面的牵引性膜。A博士是位于某市区的视网膜中心的视网膜疾病专家。

*本视频采访中所述的观点仅代表相关医师的个人意见，并不一定代表其所属的机构的观点。

采访转录

A博士，是一位视网膜疾病专家。某市视网膜中心专注于研究视网膜内科和外科疾病，在某都市区设有诊疗机构。在此之前的十多年中，曾在某大学的眼科研究所担任教职，负责培训视网膜领域的研究员。在医院进行手术治疗，经常使用特定的眼科显微镜。

实际上，医生们很早便开始使用眼科显微镜了。A博士在担任住院医生和研究员期间就提供过相关的培训，临床治疗中也有使用。因此，当医生要升级手术室显微镜时，医生自然希望尝试zuixin款的眼科显微镜。现在A博士要分享一款眼科显微镜。A博士所在医院早在2018年初便引进了一款眼科显微镜。 它的清晰度更高，景深更大，这一点令医生感触颇深。此外，它还能够很好地集成非接触眼底广角观察系统，整个流程都是无缝式操作。最为重要的一点是集成的术中OCT技术或EnFocus系统。医生已经在很多手术中使用过，效果非常好。

可以说，EnFocus已经成为医生的一项重要工具。熟练操作后，会发现它的优势也越来越多。在糖尿病玻璃体切割术中，医生尤其会使用到它。对于部分患有糖尿病玻璃体积血的患者，当在门诊进行检查时，很多时候，他们的视力都极其有限，无法清晰地看到他们的视网膜黄斑。一旦这些患者进入手术室，医生将积血清除后，便可以看到视网膜黄斑，对这些患者进行OCT，可以帮助医生了解是否存在黄斑裂孔、视网膜前膜和其它可能存在于视网膜表面的牵引性膜。因此，在糖尿病患者治疗中，眼科显微镜的效果非常好。

针对糖尿病牵引性视网膜脱离的情况，当医生尝试确定解剖面时，术中OCT非常好用。 医生还会将其用于黄斑下出血的情况，在这种情况下，医生会用它来取代视网膜下组织型纤维蛋白溶酶原激活剂。眼科显微镜可以帮助医生进行定位。它还可以帮助进行玻璃体黄斑牵引，确保在手术结束时释放存在的任何牵引。基因治疗是另一个它可以发挥重要作用的领域。现在越来越多的面向视网膜下间隙领域的基因治疗药物正在进入临床研究阶段。 所以，未来术中OCT将成为视网膜下间隙定位以及基因药物给药的关键应用。

眼科显微镜的脚踏开关是医生喜欢的一项功能。它采用完全定制化设计，可以用于控制眼科显微镜的各个方面和术中OCT模式。医生可以使用脚踏开关，根据需求灵活地打开和关闭OCT模式，还可以调整OCT的焦距。灵活方便的操控会给人带来很好的使用体验。眼科显微镜的可视化也是医生非常喜欢的一个功能。在观察眼后节或使用双目镜时，融合光学可以提高清晰度、优化景深。 它与非接触眼底广角观察系统无缝集成。这个特性有助于改进工作流，例如当医生开始进行玻璃体切除术时，显微镜的光线会关闭，自动倒像。这类模式极大地优化了我们的工作流程。

助手镜也有亮点。在与住院医生和研究员合作时，医生经常会使用助手镜，在这个方面，眼科显微镜有一个很大的优势，就是在助手镜中看到的和从主刀镜中看到的视野是完全一样的。 这一点非常有用。最后一点是记录，在工作中，医生经常需要录制手术过程和编辑视频，借助高清摄像头和好的记录系统，我可以连接外接硬盘并在联机状态下进行编辑，不仅高效，而且成片质量很高。

眼科显微镜和EnFocus OCT有助于改进临床效果，尤其是在糖尿病玻璃体切除术中。就像前面所说，借助视网膜黄斑状态的实时信息，医生可以更好地制定手术决策。简而言之，它有很多实用性功能，医生可以亲自体验一下。在临床评估中，眼科显微镜和EnFocus的优势尤其明显，使用术中OCT，医生可以获得高的清晰度，更好地发挥技术优势，而且用顺手后，会逐渐发现越来越多的优势。

眼科手术必须满足高精 准度的要求，才能让手术操作和组织操作达到理想效果。在帮助眼外科医师在眼科手术中获得高精 准度和提升手术效果方面，眼科手术显微镜发挥着重要的作用。

关键经验

医生在眼科手术中使用内置于眼科手术显微镜的EnFocus术中OCT成像系统，获得了更加清晰的手术视野。借助这一先进的技术，眼科医生可以看到眼底下组织的细节，并在手术过程中实时确认组织对手术操作的反应。

医生介绍了EnFocus术中OCT成像系统为白内障手术分析提供的多种优势。介绍了成像系统如何有助于在白内障手术中获得理想的精 准度，包括手术过程中准确评估切口结构

关于EnFocus

EnFocus是用于眼科手术显微镜的术中OCT。它可以呈现出高度清晰的实时眼前节和眼后节图像，便于观察眼底下表面显微结构。除了角膜移植术和白内障手术，在角膜、青光眼和视网膜手术中，术中OCT同样可以提供相同的优势。它也是基因治 疗中一项重要的辅助工具。EnFocus可以结合眼科手术显微镜使用，提供全面的可视化效果。

*免责声明：本文中医疗专业人员的陈述和解释仅代表其个人观点和经验，并不代表其所属机构的观点。

现介绍OCT另外一种有趣的用途。它可以在白内障手术中提供宝贵的切口结构信息。

手术开始阶段的切口结构分析

从眼科手术开始阶段，术中OCT便可以提供关于切口结构的准确信息。医生可以准确地确定切口长度以及浅表和深部皮瓣的厚度。我们可以同时对纵断面和横断面进行分析。

切口分析：缝合前

这里，医生可以在手术结束后分析切口的结构。在缝合前，注意到切口的横断面呈不规则的椭圆形。

切口分析：缝合中

切口经过了调整。可以看到它的横断面呈更加明显的椭圆形。在纵断面上，可以看到一个更笔直的切口，而且内外部都有间隙。

切口分析：缝合中和缝合后

医生可以使用术中OCT来分析缝合过程中切口结构的变化。注意到切口的路径消失了，隐于角膜水肿之中。在这里，可以看到缝合前和缝合后的切口。

切口分析：非密封切口的特点

当医生分析密封切口时，切口的路径是不可见的。注意到角膜的前表面曲率是比较规则的，而角膜后表面的角膜水肿则伴有隆起。

在非密封切口中，尽管已经完成了缝合，医生注意到在这种情况下仍然存在内部间隙和局部后弹力层脱离。

在这种情况下，尽管已经缝合，但切口的路径仍然可见。医生还可以分析横断面。在这种情况下，观察到切口结构是倾斜的。这就解释了为何切口是未密封的。

切口分析：缝合后

缝合非密封切口时，它的路径变得不可见。尤其要注意前表面曲率几乎没有变化。因此，曲率调整主要针对于后表面，它变成了一个双凸点。

结论：

提高白内障手术的质量

根据医生的经验，术中OCT可以提供很多有趣的切口结构信息。它是实现更加细致和准确的分析的有效工具，有助于提升白内障手术的质量、精 准性和整体效果。

凭借显著优化视野的高jingzhun性和同步性，眼科手术显微镜术中OCT成像系统可以帮助眼科医生在眼科手术中实现高水准的手术效果。

眼外科医生分享了在白内障和视网膜手术中使用眼科手术显微镜术中OCT的经验。

关键经验

眼科手术显微镜有一种内置术中OCT的高级成像解决方案，设计用于改善眼前后节手术的工作流程，实现高精准度。

医生分享了在白内障手术中使用眼科手术显微镜术中OCT成像系统的体验。医生特别强调了使用这款成像解决方案在检测和处理残余晶状体碎片的优势。由于这些晶状体碎片会被手术切口或水肿遮挡，因此很难看到。眼科手术显微镜术中OCT可以有效定位残留晶状体碎片，从而改善手术效果，降低术后并发症和二次手术的风险。

关 于 EnFocus

EnFocus是用于眼科手术显微镜的术中OCT。它可以呈现出高度清晰的实时眼前节和眼后节图像，便于观察眼底下表面显微结构。除了角膜移植术和白内障手术，在角膜、青光眼和视网膜手术中，术中OCT同样可以提供相同的优势。它也是基因治疗中一项重要的辅助工具。EnFocus可以结合眼科手术显微镜使用，提供全面的可视化效果。

免责声明：本文中医疗专业人员的陈述和解释仅代表其个人观点和经验，并不代表其所属机构的观点。

残留晶状体碎片评估

除了视网膜手术这一典型的适用领域，术中OCT在白内障手术中也能够发挥重要的作用，尤其是用于评估残留晶状体碎片。

手术结束时，我怀疑存在晶状体碎片。借助术中OCT，可以突出显示残留碎片。碎片尺寸较大，隐藏在主切口的水肿后面。

当碎片尺寸相对较小，隐藏在辅助切口后面。然而，这些碎片受切口附近的角膜水肿影响，很难发现。这时候术中OCT便可以发挥重要的作用。

一般是对眼后节进行360°环形扫描。使用显微镜脚踏开关，可以返回手术区域并分析图像。这样就可以看到辅助切口水肿后面有一个隐藏的残留碎片。

在别的眼科手术中也能看到虹膜角膜角度有微小的残留碎片。

术中OCT的优势

在眼科手术中，术中OCT可以在白内障手术中发挥重要的作用。医生可以用它发现残留碎片，避免几天或几周后进行二次手术，还可以减少术后并发症。所以说，术中OCT是一种提高白内障手术质量和完善性的有效工具。

会议概况

BIONNOVA 细胞与基因治 疗广州论坛将于 2023 年 2 月 21-22 日在广州举办，本次论坛就当前免疫细胞、干细胞、溶瘤病毒、基因编辑等研发路线上的进展和突破、创新疗法的注册申报和临床开发、细胞与基因治 疗生产工艺的技术突破、以及药物开发过程中的分析和质控等议题展开探讨。

会议时间：

2023 年 2 月 21 日 - 22 日

会议地点：

广州翡翠希尔顿酒店

会议日程：

安捷伦作为本次会议的参展商，细胞分析部门将携“基因与细胞治 疗创新性解决方案”，在A08展台期待大家的莅临。

第三期：

术中OCT：基因治 疗程序的专家见解

课程简介：

来自英国伦敦摩菲眼科医院和大奥蒙德街儿童医院的 Robert Henderson 医师和来自比利时根特大学医院的Fanny Nerinckx 博士将解释术中OCT如何支持基因治 疗程序以及它如何为外科医生提供有价值的信息。他们将各自分享他们实践中的临床案例。

讲者：

Mr. Robert Henderson

高级眼科顾问医师

伦敦摩菲眼科医院和大奥蒙德街儿童医院

英国

Dr. Fanny Nerinckx

前后节眼科医师

根特大学医院   比利时

第二期：

术中OCT提升您的手术体验：视网膜下注射基因治 疗

课程简介：

术中 OCT 在您的视网膜手术中发挥作用，实时揭示表面下隐藏的细节。位于俄亥俄州辛辛那提的辛辛那提眼科研究所和辛辛那提儿童医院的医学博士 Robert Sisk 将讨论他们如何在日常实践中使用配备 OCT 手术显微镜。通过将术中 OCT 整合到他们的实践中，Sisk 博士和 Davis 博士能够在复杂的手术过程中更有信心地进行手术，从而提升手术经验和患者的治疗 效果。

讲者：

Robert A. Sisk  博士

辛辛那提儿童医院眼科研究中心  美国

第四期：

前节手术的技术趋势：术中OCT与3D可视化手术

课程简介：

来自英国南安普顿大学医院的David Anderson医师和来自罗马尼亚Oculus 眼科诊所的Ozana Moraru博士将分享新兴技术趋势如何改变眼前节手术。他们将通过临床病例和手术视频讨论术中OCT和3D的价值。

讲者：

Mr. David Anderson   

高级眼科顾问医师

南安普顿大学医院   英国

Dr. Ozana Moraru

眼科医师

欧科路斯眼科诊所  罗马尼亚

最近一段时间，随着疾病诊疗的精 准化，各个版本新冠诊疗指南的出炉，淋巴细胞亚群、精细亚群和细胞因子等与免疫力监控高度相关的指标受到了高度关注。

在众多的免疫指标中，选择哪些监测指标，如何建立自建方案并验证，如何建立与疾病诊疗相关指标的Cutoff值，这些都是当下流式工作者们开展更多免疫指标时会遇到的一些难题。下面这篇文章对上面提到的几个问题做了详细的解答。

01.背景介绍

免疫检查点抑 制剂治 疗，特别是联合PD-1/CTLA-4 阻断，显著提高了转移性黑色素瘤患者的治 疗率和总生存率 。但同时，与免疫相关的不良反应，如肝炎和结肠炎，是免疫抑 制剂治 疗过程中常见的并发症，其严重的时候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨细胞病毒 (CMV)引起的特异性记忆 T 细胞反应会导致肝损伤，而有研究表明治 疗前血液中 CD4+ 效应记忆 T 细胞 (TEM) 的扩增能够可靠地预测肝炎；所以如果有一种方案可以监测效应记忆T细胞，从而预测不良反应的发生，其将具有很好的临床意义。

本文章作者开发并验证了一个10色流式细胞方案，用于可靠地量化外周血样本中的 CD4+ TEM细胞和其他 irAE 风险的生物标志物。与以前的方案相比，文章作者的新方案在测量CD4+ TEM细胞方面表现出色，并且在从CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T细胞（Naïve T）分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央记忆T细胞 (TCM) 方面表现出色。它还能够精确量化 CD14+单核细胞。

02.实验方案

CD4+ TEM细胞的标记为CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。单核细胞的相同标记为 CD45+CD14+，同时加上将 CD16，以对经典、中间和非经典单核细胞进行更精细的分类。有研究表明将 CD8+ T 细胞中的 CD279 (PD-1) 表达确定为黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 疗后临床反应的标志物 ，因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。为了提高细胞类型定义的准确性，方案中还包括了一个谱系排除 (Lin) 通道（CD19、CD20、CD56 和 CD66b）来排除B 细胞、NK 细胞和粒细胞。因此，新panel包括 10 个参数：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16，作者将该方案命名为“monocyte and T cell”，简称“MoT”。

该方案用Beckman Coulter的液体试剂进行验证，并在验证完成后，作者将该方案定制成干粉形式，由于干粉产品相比较液体试剂，不仅可室温保存，并且保存时间更久，同时还可以减少实验操作，样本间一致性也更高等优点，便于日常诊断工作并最 大限度地减少差异。

贝克曼库尔特公司不仅可以提供Duraclone干粉成品试剂，还可以提供客户定制CDS，可以根据客户需求，个性化组合定制干粉方案。相比较液体方案来说，定制化的干粉组合方案，不仅有液体单抗方案的自由组合的优点，而且还有干粉试剂的优点。

03.方案圈门策略

该方案用贝克曼库尔特公司的Navios 3激光10色仪器进行数据的采集，并使用Kaluza软件进行分析。

3.1  对CD45+ 白细胞进行圈门；

3.2  对CD3+ T 细胞和CD3- 细胞进行圈门；

3.3  对CD3-内的谱系阴性 (Lin-) 细胞进行圈门；对CD14+ 单核细胞进行圈门；对由 CD14 和 CD16 表达定义的单核细胞亚群进行圈门；

3.4  对CD3+ T 细胞内的CD4+ 和 CD8+ T细胞进行圈门；对CD4+ 记忆T细胞亚群进行圈门；圈门CD279+ CD8+ T细胞。

04.检测性能验证

文章作者将此方案与贝克曼库尔特公司的DURAClone IM T 细胞亚群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了来自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的样本，其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 单核细胞外，其他参数均观察到方法之间的强相关性，CD14+ 单核细胞显示出中等相关性。

DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是贝克曼库尔特公司的Duraclone IM全套抗体组合方案中的第1管与第3管。该产品的优点是干粉，保存的时间比液体更久；而且预混抗体也能节省实验时间，相比于自己混匀抗体后分装染色，样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO 9001认证标准（ISO 9001-2008）。

文章作者之前确立了一个cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子。因此在将患者分类为 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 时，DURAClone IM T 细胞亚群管和 MoT测试管结果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外，E图显示在确定 CMV 血清学状态，并在治 疗开始后 12 周内评估免疫相关肝炎的发展。红色虚线表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值， 中值用黑线表示，MoT 方案在预测 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表现良好。F图显示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正确预测了肝炎。

经过验证，文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子，相关的PPV=83%，NPV=80%。

另外，文章作者还从批内精密度、批间精密度、操作者间分析精度、样本稳定性、样本染色稳定性、年龄、性别和疾病相关偏倚、季节性等方面进行了验证，确保该方案结果是在可接受范围内的，由于篇幅的关系，就不一一列出来了，感兴趣的读者可以去原文查看，其详细的介绍了作者验证思路与结果。