利用光学吸光度在kHz速率下对微流体液滴进行声学分选

采用HFE Novec 7500 (3m，美国)含1.8% FluoSurf表面活性剂(Emulseo，法国)的氟化油为连续相，水溶液为分散相形成液滴。表面活性剂用于稳定液滴界面，防止液滴在重新注入芯片时破裂或合并。

液滴微流控技术使人们能够满足日益增长的筛选大型生物样本库的需求。吸光度光谱通过无标签目标识别补充了荧光检测的黄金标准，并提供了更多的可量化数据。然而，这受到速度和灵敏度的限制。在本文中，我们通过加入声流体来提高分选速度，实现了1 kHz的目标液滴分选率。我们改进了微流控PDMS光聚焦准直装置的吸光度检测装置设计，利用集成透镜对样品进行基于纤维的问询。这种光学改进减少了散射和折射伪影，提高了信号质量和灵敏度。这种新颖的设计使我们能够克服基于介电分选的限制，例如液滴大小依赖性，样品的材料和介电性质。我们的声波激活吸收分选机消除了对偏移染料或匹配油的需求，并且比当前的吸收分选机更快地进行分类。

一个简单的常规的微流体液滴小球产生实验系统由多通道压力流量控制器OB1 MK3+，倒置光学显微镜和高速相机，微流体质量流量计BFS1+和微流体流量传感器MFS2、PDMS液滴芯片套装及Emulseo FluoSurf HFE7500连续油相等组成。

只需要简单的三步（连接装置，推入液体，调节流速），便可产生所需要的液滴小球。

如果动手能力强的话，可以自行在实验室搭建显微成像平台（利用无限远平场物镜、放大倍数的镜筒和相机等的组合），也可以搭建液滴产生系统。

FluoSurf HFE7500或FC40氟化油具有生物相容性，兼容PDMS芯片，可以延长PDMS芯片的使用寿命。我司备有大量的emulseo FluoSurf表面活性剂，随时满足您的应用需要如单细胞分析、数字PCR、液滴小球包裹、细胞培养、化学反应过程控制、水凝胶合成、氢胶合成等。

下图是FluoSurf表面活性剂和微流体液滴实验系统平台的实物照片。

电阻抗检测技术广泛应用于材料科学、生命科学、食品安全、疾病诊断等领域。在微流控领域，电阻抗检测技术可应用于单细胞或微液滴的检测与分析、生物组织分析、细胞计数、细胞分选、交流介电电泳（DEP）和生物阻抗测量等。实验室内的微流控电阻抗检测系统在一定程度上可以看成是由多个不同功能的模块经过有效的有机组合而成的。该检测系统主要包括五个模块：微流控电阻抗检测芯片、微流控芯片进样泵、流量计或压力计、电阻抗分析仪/锁相放大器、光学显微镜等，如下图所示。

对于以上四个模块的组合，我们仅仅给出一个微流控电阻抗检测系统的连接示例，如下图1所示。对于该系统中所用到的设备，可以使用其他的实验设备进行代替，但是总体的连接方式是相同的。MFCS或者OB1Mk3驱动泵把储液池内的液体推入到微流控芯片的通道内。MFLI或者HF2LI产生一个或多个不同频率的正弦电压信号，施加在电阻抗芯片的激励电极上，敏感电极测量到的电流信号经过跨阻放大器转化为电压信号并对信号进行放大。放大后的电压信号输送到MFLI或者HF2LI锁相放大器。MFLI或者HF2LI锁相放大器和MFCS或者OB1mk3驱动泵的参数调节和控制都在PC电脑上的LabOne软件和MAESFLO软件或者Elveflow Smart Interface上进行设置。

图1 微流控动态电阻抗检测系统连接图

HF2仪器与电阻抗芯片连接的实物图

如下以瑞士苏黎世仪器的MFLI锁相放大器连接电阻抗芯片为例介绍微流控动态电阻抗检测的原理。

MFLI锁相放大器与电阻抗芯片的连接图

动态电阻抗检测可用于测量微流体芯片通道内单个粒子的介电特性。以两对共面电极的微流控电阻抗芯片为例介绍动态电阻抗检测的过程，芯片结构示意图[8]如上图所示。在微流体芯片通道内加工两对金属微电极，一对微电极作为测量电极，用于测量介质溶液中单个粒子经过时的电流变化，而另一对电极作为参考电极，仅用于测量介质溶液的电流。当MFLI锁相放大器对两对电极同时施加一定幅值且具有一个频率或多个不同频率的交流信号时，微流体芯片通道内两对电极之间会产生电场。当粒子经过电极对之间的间隙时，电场会受到扰动而产生电流的变化，电流变化的幅度取决于粒子的尺寸、形状和介电性质。变化的电流经跨阻差分放大器进行放大并转换为差分电压信号。MFLI锁相放大器同时解调一个频率或多个不同频率的差分电压信号，从而给出每一个频率信号的同相分量和正交分量或者幅值和相位值，同时抵制所有其他频率信号的干扰。所测量的电阻抗的变化可在本地电脑上的LabOne软件里的Plotter进行实时观察且测量的数据可直接保存在本地电脑，方便后续使用MATLAB、Python等软件进行分析处理。

LabOne软件显示动态差分测量的显示曲线

带有共面金属电极的PDMS芯片中产生油包水微液滴，石蜡油为连续相（含span80表面活性剂），经过滤后的去离子水为分散相。产生的微液滴如下视频所示。

MFLI锁相放大器动态差分输入检测PDMS芯片中产生的微液滴视频如下所示。

吸光度是用来衡量光被物质吸收程度的一个物理量。利用光谱技术测量吸光度简便高效，因此被广泛应用于液体和气体的吸光度测量，用于科研分析，还可集成至工业测试系统中。

为了评估新产品Ocean HR2吸光度测量性能，我们在蒸馏水中测量了近30种不同浓度的503mg牛血清白蛋白（BSA通常用作生化应用中的蛋白质浓度标准品）样品。

实验配置

本次实验的配置包括海洋光学Ocean HR2高分辨率光谱仪（190-880 nm）、一个带衰减器的氘钨卤素光源、一对400μm光纤和一个带比色皿支架的石英比色皿以及OceanView操作软件、 OceanDirect二次开发包。

数据及分析

为了确保最 佳的测量结果，我们首先将光谱仪和光源预热30分钟，使光源处于热平衡状态。此外，为了防止出现误差，我们无需将比色皿从比色皿支架上取下，而是在比色皿中直接进行稀释，使用一次性移液管加入部分样品，然后再加入去离子水混合，并针对每个样品重复该操作过程。

图1. 牛血清白蛋白样品在280nm处吸收峰

我们的测量集中在280nm处的BSA吸光度峰（图1），其吸光度线性为0.999，极限值高达2.5 AU（图2）。这种性能水平将有利于量化大多数类型的蛋白质浓度，所以非常适用于生物方面的应用，包括药物配方的质量监测。

图2. 在近30个BSA样品上测得的吸光度线性度高达0.999

高速平均模式提高信噪比

高速平均模式（HSAM）是通过OceanDirect二次开发包实现的一种基于硬件加强信号的功能，可提高海洋光学光谱仪的信噪比性能。信噪比越高，光谱质量越好，结果越准确。

高速平均模式可以在给定时间段内进行更多次的平均，从而提供更高的信噪比，OceanDirect设备驱动程序可以在200毫秒内处理10,000个平均值，速度提高了10倍。这对于时间要求高的应用和实时应用非常重要，在这些应用中，必须非常快速、准确地做出判断。

总结

高分辨率（<1.0 nm FWHM）

高速采集（1 μs 积分时间）

高信噪比（380: 1）

Ocean HR2 集“三高”于一身的特性，使其成为蛋白质样品浓度测量、分子诊断、制药材料污染物鉴定等多种应用的理想选择。

Ocean HR2 在实验室和生产线上的表现都相当出色，为客户提供科研级光谱仪的性能。既能作为独立设备使用，也可以作为集成设备中的关键子系统或组件。

细胞是生物结构和功能的基本单元，在类型和状态上有很大差异。在大多数生物系统中，我们对细胞多样性的认识是不完整的，就像神经系统（脑细胞）这样的复杂组织[1]。单细胞识别和功能的表征，作为对每个细胞的功能和反应的理解，将加速生物领域的发现。它可能是癌症、肿瘤，几何任何可能在细胞群中具有多样性的东西。然而，今天的技术并不能提供一种简单的方法来同时分析大量的单个细胞。快速、可扩展的液滴测序（Drop-Seq）这种方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。

Drop-Seq的原理和好处
Drop-Seq是一种基于使用微流体技术的方法，通过将它们封装在微小液滴中进行平行分析，可以快速分析数千个单个细胞。

这些纳升级水性隔离室已用于微流体器件中的许多应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，但也作为PCR和逆转录的微小反应室[3]。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔成纳升大小的反应室，用于分析其mRNA转录物，同时使用分子条形码策略记住转录物的起源细胞。通过这种技术，一个科学家每天可以制作10000个单细胞库，实验并行进行且简单。因此，该方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型产生基因表达的分子图谱。

Drop-Seq利用微流体的优势

（1）很短的时间内有很高的吞吐量

（2）尽量减少昂贵样品的消耗

Drop-Seq包含以下步骤

1. 从组织中制备单细胞悬浮液
2. 准备条形码引物（或者在微颗粒表面或者在内部）
3. 使用微流体装置将每个细胞单独地与一个微小条纹的微粒共同包覆或封装在一个微小的液滴中
4. 一旦分离成液滴，裂解细胞，释放它们的mRNA，然后与引物（primers）杂交。
5. 打破液滴并产生STAMP（附着于微粒的单细胞转录组）
6. 放大STAMP
7. 测试和分析：使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞

Drop-Seq可以使用2种beads：
A：“简单”的微粒
B：水凝胶微粒

该项工作的ZD是“简单”微粒的使用，并简要介绍了水凝胶微粒，其原理保持不变。

Drop-Seq使用简单的微粒
1. 从复杂的组织中准备单细胞悬浮液
将复杂组织解离成单个细胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过108个单独的引物，它们共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“细胞条形码（cell barcode）”，但具有不同的独特分子标识符（UMI）。事实上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，这允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码，仅在相同微粒的所有引物上相同但与其他beads上的细胞条形码不同，允许回复细胞的起源。每种引物上不同的UMI允许对mRNA转录物进行数字计数并鉴定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。

细胞条形码的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
为了产生细胞条形码，将微粒库重复分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，向其中加入四个DNA碱基中的一个。然后，在每个循环后将微粒合并在一起，并进行总共12次分裂-池循环（split-pool cycles）。结果是一个微粒库，每个微粒具有4^12（16,777,216）个可能的DNA碱基序列之一。[4]

合成独特的分子标识符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循环完成后进行。将所有微粒一起进行八轮简并合成，每个循环期间可获得所有四种DNA碱基，使得每个单独的引物接受4^8（65,536）种可能序列（UMI）中的一种。[5]

3. 微流体装置
一旦单细胞悬浮液和微粒准备就绪，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含细胞，另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物beads。

微流体装置
组件列表
（1）倒置显微镜
（2）压力控制器+3流量传感器/三个注射泵
（3）3个falcon管/3mL注射器
（4）磁力搅拌系统
（5）用于实验装置元件连接的微流体导管
（6）微流体配件和连接器
（7）PDMS共流微流体液滴生成装置
（8）用于beads的100微米细胞过滤器
（9）用于细胞的40微米细胞过滤器
（10）计数室

实验装置连接示意图

4. 细胞裂解和RNA杂交
在液滴形成后，立即将每个细胞在液滴内裂解并释放其mRNA。然后，它们与其伴随的微粒表面上的引物杂交。

5. STAMPS产生
为了一次有效地产生数千个STAMP，通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量mRNA测序，以分析任何所需数量的单个细胞。

7. 测序和分析
使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。首先，将读数与参考基因组比对以鉴定cDNA的起源基因。接下来，通过细胞条形码组织读数，并且对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行数字计数。这是UMI发挥作用的地方，避免从同一mRNA转录物中重复计数序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。

使用水凝胶微球的Drop-Seq测序
关于水凝胶beads的使用，操作原理或多或少与以上保持相同，即Z大的区别在于引物（primers），它们位于微粒内而不是位于它们的表面上。

为此，微流体装置由三个通道而不是两个通道组成：
（1）带beads的一个通道（Z关键的部分）
（2）把细胞带入液滴的一个通道
（3）带来我们需要进行分析的化学试剂的一个通道

至于“简单微粒（simple microparticles）”的使用，水凝胶beads含有可用于逆转录反应的引物，然后随后对液滴内的细胞内容物进行条形码编码，由此获得作为RNA序列的拷贝的DNA序列的集合，并且现在通过它们来自哪一个液滴来对这些序列进行分类。

然后，可以打破液滴并将整个细胞群作为大量样品处理，知道每个细胞已被单独编码。

相关的资源
开源链接：McCarroll Lab

液滴测序：Droplet-Sequencing

参考论文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。

Ocean HR2光纤光谱仪凭借其专有的CCD阵列探测器和低杂散光光学平台设计，为从等离子体监测到药物分析等各种应用提供了优异的光谱性能。本次测试，将聚焦海洋光学HR2光纤光谱仪的吸光度线性度以及高分辨率性能。

关于Ocean HR2

海洋光学Ocean HR2高分辨率光纤光谱仪结构紧凑，坚固耐用，积分时间快至1μs，热波长稳定性——漂移小于每摄氏度0.06个像素，可在温度变化时保证可靠的光谱性能。它涵盖 ~190-1150 nm 内各种波长范围，可选狭缝尺寸，以帮助用户控制光通量和光学分辨率。

Ocean HR2光谱仪可与海洋光学光源、附件和软件兼容，允许用户针对不同的应用优化。此外，每台HR2海洋光学光谱仪都配有Ocean Direct，这是个功能强大的跨平台软件开发工具包，带有应用程序编程接口。

吸光度测量：重铬酸钾标准品

为测试海洋光学HR2光纤光谱仪的吸光度线性度，测量了重铬酸钾吸光度标准品，每种样品的浓度水平都不同。

测量吸光度实验包括海洋光学HR2-UV-VIS光谱仪、带衰减器的DH-2000氘灯光源、两根400 μm光纤，石英比色皿、Square One比色皿支架和海洋光谱仪软件OceanView。

图1.重铬酸钾标准品的紫外吸光度

（浓度范围20.27-100.95 mg/L）

图1为使用Ocean HR2测得的紫外吸收谱，可看出Ocean HR2出色的低杂散光性能，特别是当绘制与浓度关系时，其吸光度线性度为0.9997（图2）。

图2.高吸光度线性度是海洋光学光谱仪HR2的一个特点。

蓝色线为重铬酸钾标准品的测量结果，基于该标准曲线，可预测该波长范围内1.5 AU以下几乎任何样品的浓度。

吸光度测量：牛血清白蛋白BSA

BSA常用作生化应用中的蛋白质浓度标准品。下面使用与重铬酸钾实验相同的Ocean HR2光谱仪配置，在蒸馏水中测量了质量同为503mg的30种不同浓度的BSA。

为确保获得更佳测量结果，建议在实验中应注意以下：

测量前，将光谱仪和光源预热30分钟。预热有助于光源达到热平衡状态，避免由于光源输出的微小变化而导致的测量偏差。

采样时避免取下石英比色皿，因为这样做可能会引入错误。正确的做法是，在比色皿中进行溶液稀释，使用一次性移液管吸取每个样品的一部分，然后在去离子水中混合，并对每个样品重复该过程。

同时，还建议避免测量中移动光纤。

图3. BSA样品在 279 nm 处有强烈的吸收峰。

使用BSA测量的吸光度线性度结果甚至比重铬酸钾更好。取279 nm处的吸收峰（图3），吸光度直至2.5AU，也能保证吸光度线线性度0.999（图4）。这种性能使Ocean HR2成为定量其他类型的蛋白质浓度及生物应用，如分析血液成分和对药物配方进行质量保证的理想选择。

图4. 近30个BSA样品上测得的吸光度线性度高达0.999。

高分辨率的Ocean HR2：识别谱线

由于光学平台优化设计，HR2海洋光学光谱仪的分辨率（FWHM）通常小于1nm。例如在测量汞氩灯气体放射光源时，在UV-VIS波段观察到很多明确的尖峰（图5）。

图5.根据配置，可使用海洋光学光谱仪Ocean HR2实现亚纳米级光学分辨率。

在测太阳辐照度时观察到类似的光学分辨率性能，25μm狭缝的Ocean HR2在其光谱范围内检测到光学分辨率小于1.2nm的光谱发射线（图6）。

采样配置包括一个连接到600μm VIS-NIR光纤的余弦校正器，该光纤被放置在反射探头支架中，并以90°对着天空。

图6. HR2海洋光学光谱仪在太阳辐照度测量中展示了其多功能性。

结语

从检测等离子体和气体中的窄发射线到确定蛋白质的浓度，Ocean HR2 光纤光谱仪在实验室或生产线上提供科研级光谱仪性能，能够胜任研究或系统集成的苛刻要求。