胱甘肽S-转移酶(GST)是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶,GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解-毒系统中,其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团,生成谷胱甘肽衍生物,具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内,GSTs是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶,分子量为23∽29kDa,由200∽240个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式,以胞液GSTs为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质,GST又可以分为多个亚类。
GST标签作用机理
1)应用于原核表达,作为一种高度可溶的蛋白,能增加外源蛋白的可溶性,在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;
2)GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性;
3)GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂(如:盐酸胍或尿素等);
4)GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具,其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用,也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。
5)GST标签的切除:①凝血酶:一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列,分别为X4-X3-P-P[K]-X1΄-X2΄和X2-R[K]-X1΄,凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②Xa因子:Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除。
GST标签纯化蛋白的优劣势:
优势:
1. 适用范围广,可在不同宿主中表达;
2. 增强外源蛋白可溶性;
3. 可用不同的蛋白酶进行去除;
4. 有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;
5. 特异性好,纯化方便且温和。
劣势:
1. 分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;
2. 仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。
GST标签纯化蛋白常见问题解析:
问题一:GST 融合蛋白的产量低或无法检测到
1、原因:融合蛋白形成包涵体
解决方案:
①采用低温(16∽25℃)培养细胞,或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至1mM,或者缩短诱导时间。
②纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇2个小时或者更长时间(过夜),充分结合后上柱纯化。
2、原因:融合蛋白可能失活
解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件,比如采用溶菌酶。
3、原因:融合蛋白被蛋白酶降解
解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑-制剂,如PMSF。
4、原因:融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来
解决方案:
①延长洗脱时间,或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至15mM或者更高调节洗脱液的pH值至8.0∽9.0。
②在洗脱液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)、辛基-葡萄糖苷(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.1∽0.2 M)。
问题二:洗脱液中有较多杂带
1、原因:融合蛋白被蛋白酶降解
解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑-制剂如PMSF。
2、原因:一些宿主蛋白,比如伴侣蛋白,可能会和融合蛋白互相作用
解决方案:
在洗涤液中加入DTT(终浓度5 mM)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl),37℃振荡10 min
3、原因:过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合
解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。
4、原因:有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合
解决方案:优化洗涤条件:加入一些洗涤剂如1% Triton X-100、1%Tween-20、0.03% SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。
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