组织芯片免疫组化方法流程和注意事项

组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray,TMA)，是自蛋白质芯片、基因芯片之后出现的又一种重要的生物芯片。组织芯片是一种将数十至上千个小组织整齐地排列在一张载玻片上而制成的组织切片，主要用于研究同一种基因或蛋白质分子在不同细胞或组织中表达的情况。组织芯片的出现，与基因芯片配合使用在寻找疾病基因中有很好的互补作用。在肿瘤研究中发挥着重要作用。将基因芯片筛选出的基因作成探针，再将探针与组织芯片中众多的肿瘤组织进行荧光原位杂交，寻找肿瘤发SF展的相关因素。

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

根据标记物的不同，免疫组化方法分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种Z常用。

人多种实体瘤肿瘤组织芯片在免疫组化染色过程中无组织脱落，不同分化程度的腺癌和鳞癌组织不等量和不同强度的表达细胞角蛋白CK，肝癌及癌旁组织、小细胞癌均呈CK阴性反应。所有组织的间质细胞表达波形蛋白Vimentin；所有组织中的血管平滑肌细胞、消化道平滑肌及子宫平滑肌瘤细胞表达SMA。免疫组化染色阳性信号清晰，组织背景干净。另外，在组织芯片免疫组化染色过程中我们注意到在芯片边缘的组织片的试剂覆盖欠佳，在镜检中相应区域内组织的免疫组化染色多呈阴性结果。

Z简单的组织芯片免疫组化流程步骤

1.石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2.取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

3.每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

免疫组化过程中的注意事项

1．固定 ：Z好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原 ，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

Bouin S固定液：饱和苦 味 酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原 有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。 PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2．蜡块及切片的保存： Z好在4℃保存

3．脱片问题 ： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前组织芯片免疫组化 染色工作中Z常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

4．切片时展片： 有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

5．烤片： 60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原 容易丢失。

6．灭活内源性酶： HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

7．暴露抗原 ： 对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的Z佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

8．组织脱水，透明 ：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

9．封闭： 在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10．抗体稀释： 应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11．背景高： 在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12．返蓝： 在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13．显色： 一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14． 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。