核酸分离与纯化的原则

核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解酶处理核酸与其他生物大分子物质分离核酸纯化等几个主要步骤每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来细胞裂解可通过机械作用化学作用酶作用等方法实现 (1) 机械作用:包括低渗裂解超声裂解微波裂解冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法 (2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相 (3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放 2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸 3. 核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质多糖脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀层析密度梯度离心等方法可将核酸分离纯化(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚氯仿抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1 体积) 混合液(2) 层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法包括吸附层析亲和层析离子交换层析等方法在内的层析法因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应,而被广泛应用于核酸的纯化该法分离纯化核酸,具有质量好产量高成本低快速简便节省人力以及易于实现自动化等优点 (3) 密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析 MSP-8600微波消解仪/MSP-8600微波萃取