在分析科学中，实现生物分子的可靠色谱分离一直是一项挑战。科学家通常采用亲水相互作用色谱 (HILIC) 检测和分离酸性代谢物（例如含有多个磷酸或羧酸基团的代谢物）。
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在分析科学中，实现生物分子的可靠色谱分离一直是一项挑战。科学家通常采用亲水相互作用色谱 (HILIC) 检测和分离酸性代谢物（例如含有多个磷酸或羧酸基团的代谢物）。在分析磷酸肽、磷酸化多糖、单克隆抗体和药物化合时，各种固定相（包括反相、离子交换和体积排阻）普遍存在信号抑制与峰形不佳的情况。这些现象通常与色谱柱及系统硬件金属表面的相互作用有关。
超高惰性技术的 Agilent Altura HPLC 柱是一款带涂层的不锈钢 (SS) 柱，其惰性涂层可阻止分析物与金属表面的相互作用，同时仍保持了不锈钢柱硬件的强度、稳定及耐高压优势。
实验部分
样品
极性代谢物包括有机酸（即谷氨酰胺、谷氨酸和苹果酸）
和磷酸化核苷酸（例如 AMP、ADP 和 ATP）
磷酸肽样品（序列信息及磷酸化残基位点详见表 1
表 1. 本研究中使用的磷酸肽的序列。(pS) 表示磷酸化丝氨酸，(pY) 表示磷酸化酪氨酸
标识符 | 序列 |
a | SFVLNPTNIGM(pS)KSSQGHVTK |
b | FQ(pS)EEQQQTEDELQDK |
c | TRDIYETD(pY)YRK |
d | TRDI(pY)ETD(pY)(pY)RK |
仪器和色谱柱：
色谱柱：
采用超高惰性技术的 Agilent Altura HILIC-Z 色谱柱， 2.1 × 150 mm, 2.7 µm （部件号 227215-924）
仪器和参数：
LC/MS 分析采用以下仪器配置：
Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A)
Agilent 1290 Infinity II Bio Multisampler，配备样品恒温箱 (G7137A)
Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B)
Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
表 2. HPLC 参数
Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统 | |
流动相 A | 0.1% 甲酸水溶液 |
流动相 B | 含 0.1% 甲酸的乙腈溶液 |
柱温 | 40 °C |
流速 | 0.4 mL/min |
进样器温度 | 8 °C |
表 3. 质谱参数
Agilent 6545 XT AdvanceBio LC/Q-TOF | |
离子源 | 安捷伦双喷射流 ESI 离子源 |
极性 | 正 |
气体温度 | 325 °C |
干燥气流量 | 8 L/min |
雾化器 | 35 psi |
鞘气温度 | 275 °C |
鞘气流量 | 11 L/min |
毛细管电压 | 3500 V |
喷嘴电压 | 0 V |
碎裂电压 | 175 V |
锥孔电压 | 65 V |
参比质量 | 322.0481，922.0098 |
MS1 范围 | m/z 300-1250 |
采集速率 | 1 幅谱图/秒 |
实验结果与讨论
采用超高惰性技术的 Altura 色谱柱在三类代表性化合物的分析中始终优于不锈钢色谱柱。
Altura 色谱柱具有优异惰性，可明显减少分析物因为吸附造成的信号损失。
图 1. 不锈钢 (SS) 和 Agilent Altura 超高惰性 HPLC 色谱柱在三类化合物中的色谱性能比较：合成肽、磷酸化核苷酸（AMP、ADP 和 ATP）和酸性代谢物（谷氨酰胺、谷氨酸和苹果酸）。合成肽采用反相 (RP) 色谱分离，磷酸化核苷酸和酸性代谢物则采用亲水相互作用色谱 (HILIC) 分离。
图 2. 通过柱状图显示，Altura 色谱柱的相对信号强度明显更高，证明了出色的惰性和更高的分析物回收率
表 4. 采用惰性色谱柱硬件改善峰形。结果表明，金属敏感性分析物的拖尾因子得到明显改善。部分分析物因完全吸附无法获得定量结果，未列入本表。多肽 “a” 和多肽 “c” 的序列参见表 1
| _ | 拖尾因子(TF) | |||||
肽段 | 代谢物 | |||||
a | c | 谷氨酰胺 | 谷氨酸 | AMP | ADP | |
不锈钢 | 1.2 | 1.9 | 1.8 | 1.4 | 2.6 | 4.8 |
惰性 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 1.3 | 1.3 | 1.7 |
△ATF (惰性-不锈钢) | -0.2 | -0.5 | -0.6 | -0.1 | -1.3 | -3.1 |
结语
在所有测试的化合物类型中，采用超高惰性技术的 Altura 色谱柱产生的信号强度是传统不锈钢柱的 2 至 3 倍。此外，使用惰性柱硬件时拖尾因子降低，表明大多数目标分析物的峰分离度得到显著提高（表 4）。这些结果证明了硬件表面的化学性质在实现可靠、高灵敏度分离方面的关键作用，对于容易与金属发生相互作用的分析物更是如此。
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