A549与Ci-hAELVi细胞共培养，VitroCell与CULTEX® 谁更胜一筹

前言

空气污染已成为全世界性公共卫生挑战，吸入性气溶胶和细颗粒物能够深入肺泡区域——这个占肺表面积99%的关键气体交换场所。肺泡由I型上皮细胞负责气体交换，II型上皮细胞产生表面活性物质，两类细胞在气液界面共同维持肺泡功能。

长期以来，吸入毒理学研究主要依赖动物实验和简单体外模型。最常用的A549细胞虽易于培养，但作为肿瘤来源细胞，其增殖失控、缺乏完整I型细胞特征、屏障功能弱等局限，难以真实反映肺泡生理状态。

法国国家工业环境与风险研究所的Alunni等人利用A549和Ci-hAELVi两种商业化细胞系，成功构建了一个可在气液界面稳定存活72小时的共培养模型。该研究同时使用了VitroCell®和CULTEX® RFS两种暴露系统，通过对比验证了模型的稳健性。本文将对这一研究的核心发现进行系统解读。

研究背景与目的

1.1 为什么需要新的肺泡模型？

空气污染通过吸入气态污染物和细颗粒物影响呼吸系统，这些物质可到达肺泡区域。肺泡占肺表面积的99%，主要由两种细胞构成：

• I型肺泡上皮细胞：覆盖95%的肺泡表面，负责气体交换
• II型肺泡上皮细胞：产生表面活性物质，防止肺泡塌陷，是I型细胞的祖细胞

然而，传统的体外研究大多依赖单一细胞系，最常用的是A549细胞。A549虽被广泛使用，但它存在明显局限：

• 源于肺腺癌，增殖失控，易形成多层细胞聚集体
• 缺乏完整的I型细胞特征
• 屏障功能弱，无法真实模拟肺泡上皮1.2 研究目的

本研究旨在开发一种新的肺泡共培养模型，使用两种商业化细胞系——A549（II型肺泡上皮样细胞）和Ci-hAELVi（I型肺泡上皮样细胞），使其适用于气液界面的长时间暴露，为吸入毒理学提供更接近生理条件的体外工具。

实验材料与方法

2.1 细胞模型构建

细胞来源：

• A549：人肺腺癌上皮细胞，ATCC编号CCL-185™
• Ci-hAELVi：人肺泡上皮慢病毒永生化细胞，InSCREENEx GmbH

细胞比例：按照人体肺泡中I型和II型细胞的数量比例，采用40% Ci-hAELVi + 60% A549。

培养基筛选：比较了RPMI 1640和huAEC两种培养基。结果显示：

• RPMI培养基中，A549增殖过快，会压制Ci-hAELVi
• huAEC培养基使两种细胞增殖速度相当，A549不再形成聚集体，形成光滑均匀的单层

气液界面适应期：比较了两种适应期——24小时和6天。6天适应表现出更好的屏障功能和稳定性。

2.2 气液界面暴露系统

本研究同时使用了两种气液界面暴露系统：

研究团队明确说明了两套系统的选择原因：“VitroCell®系统……不允许超过24小时的长时间暴露。CULTEX® RFS，更最近开发并由我们实验室购置，允许长时间动态暴露于气流。”2.3 暴露条件优化

• 气流速度：10 mL/min/insert
• CO₂浓度：约5%（维持培养基生理pH，避免使用HEPES）
• 温度：37℃（循环水浴控制）
• 相对湿度：约80%（通过预热培养基自生，避免细胞干燥）
• 预热时间：暴露前30分钟将培养基加入腔室并加热至37℃，使腔室内湿度达到饱和后再放入细胞2.4 阳性对照

• ZnO气溶胶：1 mg/m³和2 mg/m³，使用CULTEX® RFS系统进行24小时气液界面暴露
• LPS：5 μg/mL和20 μg/mL，浸没暴露24小时
• Triton X-100：1%，2小时暴露，作为细胞毒性阳性对照2.5 检测指标

• 细胞毒性：LDH释放
• 代谢活性：PrestoBlue™ assay
• 屏障功能：TEER、荧光黄通透性
• 基因表达：RT-qPCR检测40+个标志物
• 蛋白质水平：免疫荧光、ELISA定量SP-B和SP-D
• 炎症因子：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α

研究结果

3.1 共培养模型的稳定性

细胞计数：

• 培养7天后，A549单培养细胞数增加1.8倍，Ci-hAELVi单培养增加0.8-1.25倍
• 共培养细胞数增加约1.0倍，且标准偏差低于单培养，表明变异性更低、稳定性更好

细胞毒性：

• 气液界面适应6天后，单培养和共培养在24小时洁净空气暴露下的LDH释放与培养箱对照无显著差异
• 代谢活性也与培养箱对照相当

长时间暴露稳定性（CULTEX® RFS系统验证）：

• 8、24、72小时洁净空气暴露后，LDH释放均与培养箱对照无显著差异
• 代谢活性在各时间点均保持正常3.2 标志物表达

基因表达：

• 共培养表达AT1样标志物：CAV1（来自两种细胞）、KRT14（主要来自Ci-hAELVi）
• AQP5和PDPN的mRNA在本研究条件下未检测到
• 细胞粘附蛋白基因CDH1和ICAM-1主要来自Ci-hAELVi
• 黏蛋白基因MUC2、MUC5AC、MUC5B在共培养中相比A549单培养明显下调
• 四种表面活性蛋白的mRNA均有表达

蛋白质水平：

• SP-B：共培养分泌量是A549单培养的4倍，是Ci-hAELVi单培养的4倍（p < 0.0001）
• SP-D：培养箱条件下，共培养分泌量是A549单培养的3倍（p < 0.0001）；空气暴露下，共培养SP-D水平下降，与单培养无显著差异

免疫荧光：

• 共培养表达AT1特异性HTI-56和AT2特异性HTII-280膜蛋白
• A549细胞HTII-280染色更强，Ci-hAELVi细胞HTI-56染色更强
• Ci-hAELVi细胞共表达AQP5和PDPN，A549细胞两种蛋白均未检测到可及水平3.3 屏障功能

• A549单培养：TEER低，荧光黄通透性>60%，屏障功能弱
• Ci-hAELVi单培养：TEER高，荧光黄通透性<30%，屏障功能强
• 共培养：TEER约300 Ω·cm²，荧光黄通透性>50%，介于两者之间3.4 功能验证：ZnO暴露

使用CULTEX® RFS系统进行24小时ZnO气溶胶暴露：

20 μg/mL LPS浸没暴露24小时：

• 代谢活性下降30%
• LDH释放无显著变化（亚致死应激）
• SP-B无显著变化（变异性高）
• SP-D显著升高
• IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α均显著升高3.6 气流本身的效应

即使暴露于洁净空气，也观察到：

• CYP1A1基因显著上调（AhR通路激活）
• CAV-1下调，KRT14上调（细胞骨架重塑）
• 促炎细胞因子有轻微升高趋势，但无统计学显著性

两种暴露系统对比

4.1 系统配置对比

从文献中可以清晰看出研究团队的选择策略：

用VitroCell®完成的任务：

• 共培养模型的建立和基础表征
• 单培养与共培养的生长对比
• 24小时洁净空气暴露后的细胞毒性和代谢活性评估
• 基因表达和表面活性蛋白分泌的定量分析

用CULTEX® RFS完成的任务：

• 72小时长时间暴露验证
• ZnO气溶胶的毒性测试
• 暴露时间效应研究（8、24、72小时对比）4.3 关键数据一致性

两套系统在24小时暴露条件下获得的数据高度一致：

1. 设备年龄不等于能力：运行超过10年的VitroCell®系统仍然产出高质量数据，说明成熟稳定的设备只要维护得当，完全可以胜任基础研究任务。
2. 长时间暴露能力是关键差异：只有CULTEX® RFS能够支持72小时暴露，这使其成为研究慢性效应的“利器”。
3. 气溶胶暴露能力是分水岭：本研究中，只有CULTEX® RFS被用于ZnO气溶胶暴露，体现了其在气溶胶毒性研究中的价值。
4. 数据可重复性比单项指标更重要：两套系统都产出了可重复的数据，证明了共培养模型的稳健性。

讨论

5.1 共培养模型的价值

本研究开发的A549/Ci-hAELVi共培养模型具有以下优势：

1. 稳定性：共培养限制了A549的失控增殖，降低了变异性
2. 功能互补：SP分泌量是单培养的3-4倍，体现细胞间相互作用
3. 长时间存活：可在气液界面稳定存活72小时
4. 反应灵敏：对ZnO和LPS均表现出预期的毒性反应5.2 与现有模型的比较

作者坦诚指出：

1. 仍为细胞系：与原代细胞存在差异
2. 缺乏免疫细胞：无法完全模拟炎症反应
3. 无机械拉伸：无法模拟呼吸运动
4. 气流本身的机械效应：即使洁净空气也会引起基因表达变化，需作为背景考虑

结论

本研究成功开发了一种A549和Ci-hAELVi细胞的共培养模型，该模型：

• 在气液界面稳定存活长达72小时
• 表达AT1和AT2的关键标志物
• SP分泌量是单培养的3-4倍
• 对ZnO和LPS表现出预期的毒性反应
• 在两种不同的气液界面暴露系统中均表现稳定

作者总结道：“这个模型在生理相关性和实际可及性之间提供了有效的平衡，非常适合用于初步吸入毒理学筛选，特别是在需要快速部署、低成本和高可重复性的情况下。”

研究设备
7.1 本研究所用设备

本研究中使用的CULTEX® RFS系统成功验证了共培养模型在72小时长时间暴露中的稳定性，并完成了ZnO气溶胶的毒性测试。德伯科技是CULTEX中国技术服务中心，其自主研发的ACP系列气液界面细胞暴露系统，是CULTEX细胞暴露系统的国产替代方案：可完全满足此类研究的实验需求：

• ACP3/6/16系列：3、6、16通道灵活配置，各通道间气溶胶均一性变异系数≤5%
• 环境控制：温度37±0.1℃，湿度≥95%，完美复刻人体气道微环境
• 长时间稳定运行：支持≥24小时连续暴露，满足长时间实验需求
• 全自动软件控制：支持气密性检测、培养基自动加注、实验程序编辑、自动清洗等功能
• 与各类气溶胶发生系统兼容：可连接Collison雾化器、粉尘发生器、烟雾发生器等
• Mistber静态暴露模块：适用于需要长时间、低流速稳定暴露的特定研究场景

德伯科技致力于为国内科研工作者提供从设备到方法学的全方位支持，助力中国吸入毒理学研究迈向国际前沿。

   参考文献

Alunni A, Simonin O, Barbier G, et al. A549 and Ci-hAELVi cell lines coculture as a new human alveolar epithelium model for air-liquid interface exposure. Toxicology in Vitro, 2026; 112:106200.

标签：细胞全烟气暴露系统气液面暴露系统ALI暴露系统