一直被模仿，从未被超越丨Agilent MHC 2D-LC/MS 液质联用技术介绍及其在生物制药中的应用案例分享

自 2014年 发布 MHC 2D-LC 系统（多中心切割），Agilent 一直在持续更新并完善 MHC 技术，旨在帮助科研工作者解决实际问题，提高工作效率。

2014 年，MHC 2D-LC 发布，可以一针进样实现最 多 11 个峰的智能存储，并依次洗脱至二维进行检测，提高效率，节约样本；

2016 年，High Resolution Sampling（HiRes, 高频采样多中心切割）功能，实现对目标峰的连续 10 片的智能存储，可用于峰纯度研究；

2017 年，Active Solvent Modulation （ASM，主动溶剂稀释）阀发布，帮助解决一维组分的溶剂洗脱至二维时产生的溶剂效应、盐效应和溶剂不互溶等问题，增加保留、改善峰型、提高质谱响应；

2017 年，MS Divert 阀发布，轻松将一维切割的组分中不挥发性盐最 大可能去除，有效降低不挥发性盐带来的质谱信号抑 制；

2021 年，Masshunter 实现对 MHC 2D-LC/MS 的数据采集和数据处理，并新增 Multi inject 实现富集效果，提高低含量杂质的质谱信号；

2022 年，BioMHC 2D-LC 发布，针对生物大分子分析的二维系统，可有效降低传统不锈钢系统对目标组分的吸附或质谱信号中存在的加合现象。

Agilent 特色 MHC 2D-LC 技术介绍

多中心切割（MHC）组件

­独特的 MHC 组件（图 1）由三个阀头组成，软件控制阀头之间联动，实现一针进样中最 多实现 11 个目标峰的智能存储和洗脱。两侧阀头各连接 6 个 loop，实现多个目标峰的存储，中间的阀头为双两位四通阀，通过阀切换实现 DeckA 或 B 和液相系统流路的连接。

图 1. MHC 的连接示意图及 Agilent 2D MHC/TOF 示意图

独特的 ASM 功能（图 2），可有效的降低二维分离时由一维带来的溶剂效应或盐效应，特别是 Oligo，当一维洗脱峰的盐浓度过高时，其在二维的反相离子对系统上会因为保留差而导致质谱信号降低，ASM 可以有效的解决上述问题；同时还可根据需要选择不同的 ASM 的体积进而实现不同的分流比。

图 2. ASM 管路为 1uL 的分流比 4:1

Masshunter 软件

­方法设置简单，只需要将一维紫外谱图导入（图 3），点击紫外谱图下的目标峰，软件就能实现对目标峰的智能存储及洗脱；

图 3. 点击目标峰即可轻松实现方法编辑（MHC 数据采集）

­一键实现所有 cuts 除盐及除盐时间的设置（图 4），设置除盐时间可以保证质谱信号的质量，同时避免高盐对质谱的污染；

­一键设置是否需要使用 ASM（图 4），避免二维分离的溶剂效应或盐效应；

图 4. 方法中的智能的峰存储及设置所有 cuts 的除盐时间及 ASM 设置

图 5. 数据采集时，系统流路状态的实时显示

实时显示峰存储及洗脱状态（图 5），清楚直观的了解流路状态；

可实现多种数据采集模式

­MHC 采集（图 3所示）：一针进样，实现最 多 11 个目标峰的智能存储和质谱鉴定，节约样本，提高效率;

­HiRes 采集（图 6 所示）：对目标峰的连续切割（可连续存储 10 片）实现对目标峰纯度的评估，如 Peptide 和 Oligo 的主峰纯度研究；

图 6. 对目标峰的连续存储的 HiRes 模式

­HiRes Multi Inject 采集：在 HiRes 模式下，可将连续存储的峰同时洗脱至二维进行分离检测，实现低含量杂质的目标峰的质谱鉴定；

­MHC 和 HiRes 同时采集：在一针进样中同时使用这两种功能时，可在杂质鉴定的同时实现对主峰的纯度检测。

Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF

大分子表征的应用案例——蛋白篇

MHC 应用案例 1

蛋白离子交换酸性碱性峰质谱鉴定

一维分离：Infinity II 1290 Bio 四元溶剂系统，配备 VWD 检测器

离子交换，A 相：50mM PBS；B 相：50mM PBS，0.2M NaCl，梯度洗脱

二维分离：Infinity II 1290 二元超高效系统，反相分离，质谱兼容的反相体系

质谱采集：Agilent 6230 TOF

数据采集及处理软件：Masshunter 及 BioConfirm12.1

实验结果

1 针进样，实现了对主峰和酸碱峰总共 5 个目标峰的质谱鉴定，通过解卷积结果发现，酸性峰 A1 和 A2 发生 Deamidation，碱性峰是由 K 的不完全切除导致（B1 和 B2 分别是 +K 和 +2K）。

图 7. 应用案例 1 分离谱图及质谱鉴定结果

MHC 应用案例 2

蛋白离子交换酸性碱性峰质谱鉴定

一维分离：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶剂系统，配备 VWD 检测器

离子交换，A 相：50mM 醋酸钠（含吐温 20）；B相：50mM 醋酸钠（含吐温 20），0.8MKCl，梯度洗脱

二维分离：Infinity II 1290 二元超高效系统，质谱兼容的反相分离

质谱：Agilent 6230 TOF

数据采集及处理：Masshunter 及 BioConfirm12.1

实验结果

1 针进样，并通过二维分离最 大程度降低吐温 20 对蛋白信号的干扰，实现对主峰和酸碱峰共 8 个目标峰的质谱鉴定，并发现酸性峰均发生序列截短，为后续的蛋白表达体统的优化提供数据支持。

图 8. 应用案例 2 分离谱图及部分质谱鉴定结果

MHC 应用案例 3

ADC HIC分离不同DAR值的色谱峰鉴定，

实现ADC的DLD测定

一维分离：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶剂系统，配备 VWD 检测器

HIC分离，A 相：2M (NH4)2SO4 溶液，25mM 磷酸盐；B 相：25mM 磷酸盐，25% IPA

二维分离：Infinity II 1290 二元超高效系统，质谱兼容的反相体系

质谱：Agilent 6230 TOF

数据采集及处理软件：Masshunter 及 BioConfirm12.1

实验结果

进样 2 针，实现对主峰 M 和小锋 N 的 14 个峰的质谱鉴定，确定主峰 DAR0（M1），DAR2（M2），DAR4（M3a 和 M3b），DA R6（M4）和 DAR8（M5）的偶联类型，其中 DAR4 主要有 2 种偶联类型，M3a 主要为轻链和重链链间的两对二硫键全部偶联药物，M3b 主要为铰链区两对二硫键全部偶联药物。

图 9. 应用案例 3 分离谱图及部分质谱鉴定结果

下期精彩预告

这期主要介绍了 Agilent MHC 2D-LC/MS 系统 10 年多完善和创新，并使用 MHC 功能实现蛋白离子交换酸碱峰的质谱鉴定和 HIC 分离 ADC 的 DLD 测定，下期我们将聚焦在 MHC HiRes 和 ASM 功能在 Peptide 和 Oligo 的应用，敬请期待。

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