肿瘤转移实验分析 - 产品信息 - 相关知识

2025-01-21 09:33:41肿瘤转移实验分析: 肿瘤转移实验分析是研究肿瘤细胞从原发部位扩散至其他部位的过程及其机制的实验方法。该实验通常涉及将肿瘤细胞接种到动物模型或体外培养系统中，观察其迁移、侵袭和定殖能力。通过分析肿瘤细胞的生物学特性、遗传变异、微环境等因素，可以揭示肿瘤转移的关键分子机制和信号通路。该分析对于理解肿瘤进展、预测转移风险及开发抗转移疗法具有重要意义。

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安捷伦公益捐赠西交利物浦大学慧湖药学院傅磊教授团队

傅磊教授团队将使用安捷伦xCELLigence 实时细胞分析仪 (RTCA)进行肿瘤转移实验分析，探究筛选化合物对肿瘤细胞中的作用。

安捷伦科技（中国）有限公司 657
2022-04-02
安捷伦xCELLigenc 实时细胞分析仪 (RTCA) 肿瘤转移实验分析

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肿瘤转移实验分析问答

2023-02-15 14:27:47肿瘤疫苗生物学活性评估: 肿瘤疫苗背景肿瘤疫苗，是一种具有预防和治疗潜力的有吸引力的替代免疫治疗选择，是近年研究的热点之一。针对肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或肿瘤特异性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特异性地攻击和破坏抗原过表达的恶性细胞，并由于免疫记忆而实现慢性治疗反应。因此，与其他免疫疗法相比，癌症疫苗提供了特异性、安全性和可耐受的治疗。根据肿瘤抗原的组分，癌症疫苗大致可以分为四种类型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫细胞的疫苗。FDA 批准的首个个性化肿瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一种基于免疫细胞的疫苗，用于激素难治性前列腺癌的治疗。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的肿瘤疫苗。图 1 肿瘤疫苗抗原呈递平台示意图肿瘤疫苗有效性评估方法生物体接种疫苗后，肿瘤抗原被带到淋巴结，进而激活抗原特异性的 B 细胞和 T 细胞，活化的 B 细胞产生的抗体及活化的效应 T 细胞会使肿瘤内胀并诱导肿瘤细胞死亡。图 2 肿瘤疫苗诱导的免疫反应示意图如何有效的评估肿瘤疫苗的有效性是一个非常值得探讨的问题，常用的肿瘤疫苗有效性验证的方法，包括细胞因子检测、CTL 活性检测、T 细胞活化标志物检测、抗体滴度检测、ADCC 检测等。1、细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞经过刺激而合成并分泌的小分子蛋白质，在免疫应答中起着非常重要的作用，因此可以通过细胞因子的分泌能力来反应疫苗诱导的细胞免疫的水平。常见的细胞因子有白介素 (IL) 、干扰素 (IFN)、肿瘤坏死因子 (TNF) 等。下面比较了几种常见的检测方法。ELISA 是一种非常经典的细胞因子的检测方法，例如在王晓东等人发表的关于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法检测接种疫苗后小鼠骨髓源树突状细胞（BMDCs）分泌细胞因子的能力，检测方法如下：BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培养基中培养，37℃下培养 6 天，然后以每孔 5×104 细胞的密度在 96 孔板中接种。以 5µM 或 10µM 的最终浓度加入疫苗抗原，孵育 24 小时。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 试剂组定量培养上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕获抗体包被 ELISA 板过夜，然后在室温下依次加入阻断液、细胞培养上清和检测抗体，孵育 1h 。最后加入终止液和显色剂，用酶标仪 (BioTek) 在 450nm 处记录 OD 值。检测结果如下：从检测结果可以看出，T7（TLR7 激动剂）的存在可以显著提升 ML/MB 抗原诱导的免疫反应。图 3 ELISA 法测定小鼠骨髓树突状细胞 (BMDCs) 分泌TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平Ankita Leekha 等人发表的关于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法评估细胞因子的分泌水平，可以作为参考。具体方法如下：从小鼠中分离脾细胞和肺细胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基础试剂盒和小鼠 IL4 ELISpot 基础试剂盒 (Mabtech, VA, USA) 进行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 检测。在 37℃ 下，在预包被抗体的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾细胞和肺细胞，培养 16-18 小时。第二天，洗掉细胞，加入生物素化的检测抗体。洗板后，加入 1:30000 稀释的 Extravidi-ALP 偶联物，室温孵育 1 小时。洗板后，每孔添加 70µL 显色液，孵育 20-30min，形成斑点，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 对斑点进行量化。每个点对应一个单独的细胞因子分泌细胞。检测结果如下：图 4 ELIPSOT 方法检测小鼠脾细胞和肺细胞分泌细胞因子的水平2、CTL 活性检测疫苗诱导的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 可以直接杀伤肿瘤细胞，起到抗肿瘤的作用，因此可以通过检测 CTL 的杀伤效应来反应疫苗的效果。常用的检测细杀伤效应的方法有很多，下表列举了一些常用的方法。王晓东等人发表的文章中提到了 LDH 检测，检测方法如下：从接种疫苗小鼠的脾脏中分离淋巴细胞（效应细胞）。EAC 肿瘤细胞（靶细胞）与淋巴细胞（效应细胞-靶细胞比例为 50:1）共培养 4h，使用乳酸脱氢 (LDH) 法测定细胞毒性。将培养 4h 后的培养上清加入在 ELISA 板中，室温下加入底物溶液，孵育 30min。最后，加入终止液终止反应，并用酶标仪 (BioTek) 在 490nm 处检测光密度。检测结果如下：相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组 CTL 细胞具有显著的杀伤效应。图 5 LDH 法测定 CTL 介导的 EAC 靶细胞的裂解水平3、抗体滴度及亲和力检测肿瘤疫苗除了可以诱导细胞免疫之外，也可诱导体液免疫，对此可通过对抗体滴度及亲和力进行检测来反应疫苗抗肿瘤的效果，ELISA 是一种非常经典的检测方法。上述关于胃癌疫苗的文章中通过 ELISA 方法测定小鼠接种疫苗后血清中总 IgG 含量，具体检测过程如下：小鼠接种疫苗后收集血液样本，通过 3000g 离心 15 分钟获得血清样本。ELISA 板预先在 4℃ 包被 BSA-MG1 过夜，然后在室温下依次加载封闭溶液 2h，血清样品 (1:50 稀释) 和检测抗体 1h。最后，在体系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和终止液，用酶标仪 (BioTek) 在 405nm 处记录 OD 值。检测结果如下：相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组抗体含量明显上升。图6 ELISA法测定疫苗诱导的血清抗体水平除此之外，在 Emily C. Gale 等人发表的关于 mRNA 递送系统及辅剂研究的文章中，通过 ELISA 的方法测定了 mRNA OVA 模式疫苗诱导的 OVA 特异性抗体的绝对含量及其亲和力。具体检测方法如下：抗体浓度：小鼠接种加强疫苗后，采集血液样品，血清按照 1:100 000 进行稀释。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 试剂，按照试剂厂家的说明进行 ELISA 实验。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 处记录 OD 值。根据标准曲线计算血清抗体浓度，表示 mg/mL。抗体亲和性：将 12 个梯度稀释的血清与恒定浓度标记 HRP 的 anti-OVA 抗体 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室温孵育 2 小时，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反应。测定 450nm 处的 OD 值。根据业内发现的单克隆抗体的共同亲和力，假设对照抗体的 KD 为 1nM 对实验组的 KD 值进行统计。这一假设仅影响报告的绝对 KD 值，而不影响实验组之间的相对差异。检测结果如下：pIC 为双链 RNA 结构模拟物，图E中比较了可溶性的 pIC 和不同纳米颗粒递送系统诱导的绝对抗体含量，从图 E 中可以看出 2B 递送系统诱导的 OVA 特异性抗体含量最高。从F和G可以看出 2B 递送系统相对于可溶性 pIC 来说诱导的 IgG 亲和力也显著升高。图 7 pIC/PBAE NPs 增强体液免疫4、ADCC 检测疫苗诱导体液免疫产生的抗体能够捕捉目标抗原，阻断这个靶分子的功能，也可以引导其他免疫细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）杀死表达抗原的靶细胞，在肿瘤治疗中，特别是血液肿瘤中，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 起着关键作用，ADCC 常用的检测方法包括细胞活力检测、LDH 检测、工程细胞株、Delfia、RTCA、细胞成像检测等。王晓东等人发表的关于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法检测 ADCC，检测方法如下：小鼠接种疫苗后，采集其血清样本（1:25 稀释），然后与 EAC 细胞（靶细胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 细胞分离试剂盒从正常 BALB/c 小鼠中分离出自然杀伤 (NK) 细胞（效应细胞），与抗体标记的 EAC 细胞以效靶比 50:1 共培养 4 小时。采用 LDH 法 (Promega) 测定细胞毒性，检测方法与之前提到的 CTL 活性检测的方法一致。检测结果如下：相对于 PBS 对照组来说，T7-MB 组产生的抗体具有显著的杀伤效应。图 8 LDH 法测定血清抗体介导的 EAC 靶细胞的裂解水平肿瘤疫苗生物学活性检测解决方案推荐本文介绍了肿瘤疫苗活性检测的常用方法，包括细胞因子检测、CTL 活性检测、抗体滴度及亲和力检测、ADCC 检测等方法，涉及到了酶标仪、成像系统、流式、RTCA、洗板分液系统等设备。Agilent 细胞分析事业部可以从多个角度为用户提供从样品处理，到结果检测再到数据分析的全面解决方案。

2022-11-16 17:08:25样本提取实验|组织研磨仪在样品前处理实验分析中的应用: 　　在分子生物学的研究实验应用中，DNA和RNA被统称为核酸，同时也是样本研究和检测的基本对象；而如何获得高质量的核酸已成为一项基本且重要的实验技术。为了更好的提取样本核酸做好样品前处理操作，通常对会选择应用组织研磨仪设备来进行操作应用。　　多样品组织研磨仪是实验室样品制备的常用仪器设备之一，可快速粉碎和均相化各种生物组织，同时，还可选择不同规格的球磨罐和磨球，以满足不同待测样本的实验需求；可对生物细胞样品进行研磨、破碎，提取样本DNA/RNA，被广泛应用于农业、生物医学、食品、质检、高校等行业领域。　　　　多样品研磨设备还可对样品实验分别进行干磨、湿磨和低温冷冻研磨，且可同时放置多个样品管，高通量大批量处理样品组织，可满足用户一次研磨前处理大量样品的需求。　　　　实验室多样品研磨设备可放置多个球磨罐也可放置可装载多个样品管的适配器搭载进行应用，能够实现对大批量样品少批次研磨的目的，同时封闭状况的离心管能够有效避免样品间的交叉污染，对于样品前处理程序参数可进行实时储存和设置调节，能够更好的处理样品组织；仪器的高速运动可带动驱动球磨罐和罐内的磨球的高速往复运转，在运转过程中可产生动能，使其对样品可造成冲击、挤压、摩擦，进而来实现对生物样品的细磨。

2022-12-06 13:04:21探秘肿瘤微环境，原位“看透”细胞因子: 细胞因子是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）中细胞通讯的关键介质，在癌症的发生、发展、治疗和预后等多个方面发挥重要作用。在过去的 40 年中，细胞因子和细胞因子受体作为癌症靶点或癌症治疗方法得到了广泛的研究。目前公认的临床前治疗策略为增强干扰素和白细胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生长抑制和免疫刺激作用，或抑制细胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎症和促进肿瘤的作用[1]。图 1 . 细胞因子在肿瘤微环境中的作用特定细胞因子的表达也与肿瘤细胞的高存活率和高转移性密切相关。其中促炎细胞因子 IL-6 和 IL-8 与多种癌症相关，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌等 [2,3]。因此，分析细胞因子的表达是一种重要的诊断工具和预测癌症预后的关键因素。非放射性的 RNA 原位杂交技术（ViewRNA ISH）是一种高灵敏度的检测细胞因子表达的有效方法，并且可以对 1 至 4 个 mRNA 目标进行多重分析。检测原理如下图所示：图 2 . ViewRNA ISH 检测原理安捷伦BioTek Cytation 5 多功能细胞成像微孔板检测系统，可容纳多达四个荧光通道同时成像，快速并出色地成多色荧光成像。仪器配备的高内涵分析软件可自动计算细胞内 RNA 的表达水平。Cytation 5 活细胞成像工作站结合ViewRNA ISH，为细胞因子研究提供了一种高效率、高灵敏度和可重复的检测方法。实验案例分享实验一．细胞因子mRNA的成像和分析为研究细胞因子mRNA 在不同营养条件下的表达情况，设置两组对照实验。阳性对照细胞培养于完全培养基中，而阴性对照细胞经过 18 小时的血清饥饿处理。随后加入 ViewRNA 探针以标记 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分别使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道对探针进行成像完成 ISH 细胞分析。图像结果表明：细胞因子mRNA 的表达在营养匮乏的条件下会显著降低。图 3 . 阳性和阴性对照组成像。HCT116 放大 20 倍图像作为（ A ）阳性对照和（ B ）阴性对照。MDA-MB-231 细胞放大 40 倍的图像作为（ C ）阳性对照和（ D ）阴性对照。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记 IL-8 mRNA ；橙色：标记 IL-6 mRNA ；红色：标记 ACTB mRNA 。接下来为了定量分析细胞因子表达，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下进行细胞核计数，以确定每孔的细胞数量（图 4A ）。然后分别在GFP 、RFP 通道进行细胞因子探针（ IL-6 或 IL-8 ）的荧光信号分析（图 4B ）。通过细胞荧光信号的比率评估不同实验条件下的细胞因子表达（图 5 ）。图 4 . 每个细胞的荧光信号分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 软件进行细胞分析圈选出 DAPI 标记的细胞核；( B ) 荧光标记的 IL-8 信号的图像分析。如图 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合准确的量化了细胞内 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。图 5 . MDA-MB-231 细胞中 IL-8 表达和 HCT116 细胞中 IL-6 表达，并以细胞数目进行校正。实验二．诱导细胞因子 mRNA 的表达使用不同剂量的 IL-1β 刺激 DU145 细胞，以分析细胞因子的 mRNA 的表达（图6）。图 7 结果显示：虽然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表达增加，但 IL-8 的表达变化更为显著，这与先前研究结果一致[4]。IL-1β 的最高剂量下，这两种细胞因子的表达减少则是由于细胞毒性。这验证了该检测方法的可行性与稳定性。图 6 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号 ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。蓝色：DAPI染色的细胞核；绿色：标记的IL-8 mRNA；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。图 7 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下 DU145 细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。实验三．抑制细胞因子 mRNA 的表达研究表明丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可调节 IL-8 ，并证明用 MAPK/ERK 抑制剂 U 0126 治疗可减少 DU145 和 MDA-MB-231 细胞中的炎症细胞因子[4,5]。为了确认这一现象并验证 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合的能力，将不同浓度的 U 0126 加入到每种细胞类型中孵育 30 分钟。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 细胞达 3 小时，而 MDA-MB-231 细胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道进行细胞计数和图像分析以评估在 U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 细胞因子 mRNA 的表达。采集的图像（图 8 ）和计算的荧光信号强度（图 9 ）证实了 U 0126 的抑制作用。此外，也验证了该方法的灵敏度，可以准确识别给予抑制剂后 mRNA 的表达变化。图 8. U 0126 抑制 IL-8 mRNA 的表达。图像显示了在不同浓度的 U 0126 处理后 ( A-E ) MDA-MB-231 细胞内 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号；( F-J ) 为 DU145 细胞。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记的 IL-8 mRNA ；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。图 9 . U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 细胞中的表达结语ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 细胞分析试剂盒和探针提供一种灵敏的方法来检测 mRNA 表达。该方法在安捷伦BioTek Cytation 5 细胞成像系统的加持下得以更更快地采集多荧光通道的图像，并更精准的计算出每一个细胞的荧光信号强度。这种检测、成像和分析的完美结合提供了一种灵敏、灵活和高通量的方法用以检测细胞因子 mRNA 的表达。参考文献：[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18.

2022-12-30 11:31:56绘制人类肿瘤微环境的空间图谱: 介绍和目标免疫系统对癌症治疗的反应可以反映患者在治疗之后是否会有良好的结果。了解肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生和治疗反应中的变化对制定个性化的治疗方案并改善癌症治疗至关重要。借助稳定和全面的超多标成像技术，可使用免疫标志物探查髓系和淋巴系细胞的谱系和结构，而且结合特定肿瘤生物标志物时，还可以捕捉多种肿瘤中TME内的免疫反应。细胞类型特征模式，结合超多标组织成像的探查能力，可以针对免疫细胞群和TME内众多类型细胞的空间相互作用提供之前无法获得的全新认识。Cell DVE超多标成像分析整体解决方案可以使用循环染色和染料失活流程对一个完整组织切片上的数十个生物标志物进行检测和成像。Cell DIVE的核心是一个精确、灵活、开放的多标记成像解决方案，可以灵活选择多标记成像研究中常用的生物标志物抗体。Cell Signaling Technology(CST)拥有丰富的经IHC验证的抗体组合，可检测TME中的关键蛋白质，实现组织中的免疫细胞检测和表型判断。CST提供抗体偶联物，这些偶联物均经过验证，可用于Cell DIVE上，并提供经IHC验证抗体与荧光团和其他检测试剂的定制化偶联。CST采用严格的IHC验证方法，随后还会在Cell DIVE平台上进行验证，可确保成功检测蛋白质。在本研究中，我们展示了使用由数十种CST生物标志物抗体™组成的新型检测模式，在多种组织类型中进行的Cell DIVE超多标成像。多标记检测模式的开发所需的优化极少，可识别复杂的细胞类型，并揭示肿瘤微环境中的细胞间相互作用。结果表征肿瘤微环境有助于理解导致患者预后不佳的新机制。肿瘤微环境比较复杂，通常在单个样本和不同患者样本中都是异质的。循环多标记染色和成像可在不同组织样本中实现TME探查，即使可用组织有限的情况下。在这项研究中，我们检查了12个完整组织或TMA切片中30多个生物标志物的表达（表1），重点是潜在的免疫治疗目标、预测性生物标志物和分割标志物。所有的CST生物标志物抗体均被连接并随机分配到一个回合。表1.研究设计：抗体和组织为了在TME中其他细胞的背景下定义免疫细胞，融合并分割了所有的生物标志物图像，并使用聚类分析和降维（UMAP）对表达进行分析。聚类分析提供了一个无偏见的方法来定义组织内的免疫细胞贡献。在这项研究中，我们展示了人类结肠腺癌（CAC；图1）的聚类分析。在这里，聚类分析将白细胞从所有其他上皮细胞和基质细胞类型中区分出来（图1C）。此外，聚类清楚地定义了淋巴细胞和骨髓细胞类别。CAC中的骨髓类亚型包括骨髓祖细胞、M2巨噬细胞和另外两个未知亚型的骨髓聚类。其他生物标志物可用于进一步定义亚型。对于淋巴类，定义了T细胞和NKT细胞聚类。另外，还确定了一个具有CD20阳性的T细胞聚类。使用机器学习进行单细胞表型分析，可以从聚类中进一步定义细胞类型。例如，在图像1D中，聚类15中的一个细胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（图1D-E；橙色圈）。聚类和单细胞空间分析被应用于研究中的所有其他组织（图2；数据未显示）。图1：CST检测模式的多标成像可在一张玻片上检查结肠腺癌（CAC）组织的免疫细胞成分（图1 A）。用多种生物标志物对玻片进行反复染色和成像（表1；图1 A、B、D板）。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（1C-H所示为CAC，正常结肠组织未显示）。聚类15（图1D-F）被突出显示，一个跨生物标志物的特定细胞用一个橙色的圆圈突出显示（图1D）。降维（UMAP；图1G）表示免疫细胞和其他聚类之间的关系。图2：CST检测模式在多种癌症和正常组织类型中的多标成像。玻片被反复染色和成像（表1；图2组织类型）。所有生物标志物显示在一张图像中。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（数据未显示）。组织特定的免疫细胞聚类是由特定的生物标志物表达模式统计出来的。在聚类之后，单细胞表型能够对聚类中的细胞群进行空间分析。方法和材料CST抗体经过了严格的验证，以确保抗体在FFPE组织上的表现。本研究中的所有抗体都是直接偶联或商业偶联物成品（表1）。偶联是使用非位点特异性化学方法进行的。抗体与四种不同的染料过量偶联，去除未结合的染料，并通过分光光度分析测量标记的程度。经过初步验证，具有最佳标记程度和浓度的偶联抗体溶液随后用于对各种人类癌症组织和正常组织的染色。组织从商业来源获得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI对组织进行成像，并自动进行自发荧光去除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的专利软件全拼接图像进行导入、融合和分析。结论使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案，用30多种CST生物标志物抗体对12个完整的组织和TMA切片进行循环染色和成像。这个CST检测模式能够识别含有不同免疫类别、细胞类型和亚型的细胞的集群。Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案可保存组织，未来进一步定义免疫细胞亚型的工作可以继续使用同一组织切片上的其他CST抗体，并与研究中所有先前的生物标志物叠加。相关产品超多标组织成像分析整体解决方案Cell DIVE

2023-03-20 14:23:30【THUNDER小课堂】肿瘤细胞中有丝分裂纺锤体的成像: 本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）实现尤文（尤因）肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节观察，从而协助本研究的进行。活细胞成像等技术在了解肿瘤进展和转移研究中至关重要。真核细胞中的有丝分裂纺锤体由中空的微管组成。它在有丝分裂期间的细胞内重复染色体分离和分裂细胞细胞骨架结构的构建过程中发挥着重要的作用。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认。简介使用荧光显微镜可以研究肿瘤形成和进展过程中组织及细胞内部发生的变化。像活细胞成像这样的技术对更加深入地了解肿瘤进展和转移是至关重要的。在真核细胞中，由中空微管组成的有丝分裂纺锤体，有助于构建复制细胞的细胞骨架结构，并在有丝分裂过程中将复制的染色体从原始细胞中分离出来。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认[1]。肉瘤是肌肉或骨骼等结缔组织中形成的一类肿瘤。尤文肉瘤和横纹肌肉瘤，分别生长于骨骼和肌肉中，是一种倾向于发生在骨骼生长活跃区域附近的儿科肿瘤。除了手术和化疗之外，电离辐射也被用于治疗这类肿瘤，但这可能会导致生长中的骨骼受到永jiu性损伤，包括不对称生长停滞、胫骨畸形及骨折概率增加等。骨骼损伤的严重度在很大程度上与骨骼接受的辐射剂量成正比。因此，我们有理由认为，选择性放射致敏肿瘤组织的策略可降低实现局部控制所需的辐射剂量，并能最大限度降低对邻近健康组织造成的间接损伤。运用体外研究和小鼠异种移植模型系统，对使用mRNA合成抑zhi剂光神霉素A预处理，可以通过改变辐射损伤的转录反应实现选择性放射致敏EWS：Fli1+肿瘤细胞的假设进行了验证[2]。结果表明，光神霉素A可以通过抑zhi参与DNA损伤修复相关基因的转录，使EWS：Fli1+细胞在体内外显著放射增敏，导致肿瘤细胞程序性死亡[2]。使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节，协助癌症研究人员获得更有用的见解。挑战在有丝分裂纺锤体成像中，可对其实现快速成像，并获得清晰的高对比度3D成像，以清晰展示重要细节的解决方案最为实用。传统的宽场显微成像速度快，检测灵敏度高，但不幸的是对于厚样本的成像通常会出现失焦不清晰或模糊的情况，这会降低对比度[3]。要阐明有丝分裂的不稳定性在癌症等复杂疾病中的作用，这需要在同一样本中进行多个关联生物学标记。方法该研究中使用了尤文肉瘤细胞（SK-ES-1）。对这些细胞进行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀释/ Dylight 488偶联驴抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀释/Dylight 550偶联驴抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342蓝）进行染色。染色后，使用介质ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）进行盖玻片封片，并通过使用63×/1.4 NA（数值孔径）的油镜进行THUNDER Imager Tissue成像。图像采集使用大体积成像解析（LVCC）[3]模式，并生成最大化投影图像数据。结果在有丝分裂过程中，α-微管蛋白（绿色）形成有丝分裂纺锤体，染色单体（蓝色）会附着在有丝分裂纺锤体上，而γ-微管蛋白（红色）集中定位在分裂细胞中的纺锤极上。通过THUNDER技术可观察到肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。清晰的图像可以展示清晰的结构，以便进行分割和进一步的分析。图1：尤文肉瘤细胞SK-ES-1 α-微管蛋白（绿色）、γ-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）染色后的最大化投影：原始图像数据（左）和THUNDER LVCC模式成像数据（右）。结论 THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]进行尤文肉瘤细胞中的有丝分裂纺锤体成像时可显著增强对比度。与传统的宽场成像相比，其可展示细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。References：1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Muñoz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.相关产品THUNDER Imager Tissue全景组织显微成像系统