反相苯基柱 - 产品信息 - 相关知识

2025-01-21 09:30:22反相苯基柱: 反相苯基柱是一种常用的液相色谱柱，其固定相表面键合有苯基官能团，具有疏水性。这种柱子适用于分离中等极性到非极性的化合物，特别适用于在反相色谱条件下对芳香族化合物进行分离。反相苯基柱具有分离效率高、选择性好、化学稳定性强等特点，在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。

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 东曹（上海）生物科技有限公司 1586
2021-03-26
反相苯基柱

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反相苯基柱问答

2025-04-14 18:30:13反相液相色谱蛋白质原理是什么？: 反相液相色谱（Reverse Phase Liquid Chromatography, RPLC）是一种基于疏水相互作用的高效分离技术，广泛应用于蛋白质及多肽的分离、纯化与分析。其核心原理在于固定相与流动相的极性差异，以及样品分子与固定相之间的疏水分配效应。以下将从分离机制、蛋白质特异性行为、固定相与流动相选择、应用场景等角度展开说明。反相色谱的固定相通常由疏水性材料（如C18、C8或C4键合硅胶）构成，而流动相为极性溶剂（如水、甲醇或乙腈）。分离过程中，蛋白质的疏水区域与固定相发生非共价结合，极性较强的分子优先被流动相洗脱，疏水性更强的分子则因保留时间延长而实现分离。梯度洗脱是优化分离效果的关键手段，通过逐步增加有机溶剂比例削弱疏水作用，从而按疏水性差异依次洗脱目标分子。蛋白质在反相色谱中的行为具有特殊性。由于流动相中常添加三氟乙酸（TFA）等离子对试剂，蛋白质可能发生部分去折叠，暴露出内部疏水残基，增强与固定相的相互作用。此外，低浓度TFA可诱导蛋白质形成伸展构象，导致其在死时间前洗脱；而高浓度TFA通过形成离子对使蛋白质构象紧凑（如“熔融球体”），延长保留时间。这种构象敏感性使反相色谱不仅能分离蛋白质，还可用于研究其构象稳定性与表面疏水性。固定相的选择需综合考虑蛋白质大小与疏水性。C18和C8适用于小分子肽段，而C4因较短的烷基链更适合大分子蛋白质，避免过度保留。流动相中，乙腈因低黏度和高洗脱能力成为首选有机溶剂，TFA则通过抑制硅醇基电离减少峰拖尾。梯度优化需平衡分辨率与时间成本，例如降低最大有机溶剂浓度可改善峰分离，但可能延长分析周期。在应用层面，反相色谱凭借高分辨率与质谱兼容性，成为蛋白质组学研究的重要工具。其典型场景包括：多肽药物的纯度分析、酶解产物的肽图绘制、翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）的检测，以及蛋白质构象变化的动态监测。例如，与质谱联用时，反相色谱可分离复杂肽段混合物，通过质谱鉴定实现蛋白质序列的高通量解析。此外，其在治疗性抗体表征中的应用也日益增多，尤其在检测聚集体与降解产物方面表现卓越。操作参数的设置直接影响分离效能。流速需根据色谱柱内径与填料粒径调整，通常内径4.6mm的C18柱推荐流速为1mL/min。压力上限需控制在柱耐受范围内（通常≤6000psi），以避免固定相塌陷。检测方法方面，紫外检测（280nm）依赖蛋白质中芳香族氨基酸的吸收，而质谱联用可提供分子量及结构信息，灵敏度更高。总之，反相液相色谱通过疏水相互作用与动态梯度洗脱，实现了蛋白质的高效分离与分析。其独特的构象敏感性、灵活的固定相选择及与质谱的兼容性，使其在生物医药与基础研究中不可或缺。未来，随着新型固定相（如表面多孔颗粒）与微流控技术的发展，反相色谱在蛋白质分析中的分辨率与通量将进一步提升。

2019-05-30 11:05:57ACE反相系统性方法开发方案: 使用ACE方法开发工具包(MDKs)进行色谱柱筛选方法开发的四个简化步骤• ACE MDKs包括了为互补选择性而精心设计的3支色谱柱。• 色谱柱筛选是一种简单而又功能强大的方法, 可以快速识别Z合适的色谱柱。• 通过筛选2种不同的流动相有机改性剂可以使方法更全面。• 以下的流程图总结了如何通过4个简单步骤执行方法开发筛选。开始diyi步：选择流动相pH和缓冲液根据分析物性质 (即pKa, logP和logD数据) 进行选择。对于未知分析物，使用酸性流动相作为起点。第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色谱柱)梯度扫描以MeOH和MeCN作为有机溶剂,进行5-95％梯度筛选。第三步：查看数据选择Z佳色谱柱和有机改性剂。第四步：方法优化如有必要, 检查温度, pH值, 梯度斜率,梯度范围等。是否实现分离？是-方法开发完成否-改变流动相条件（pH值,缓冲液等），回到第二步继续实验。选择色谱柱和粒径尺寸。由LC系统和用户的偏好决定。对于400 bar的HPLC系统来说, 5μm 150 x 4.6mm是个不错的选择。对于600 bar优化的HPLC系统, 可使用2 和3μm粒径的较短色谱柱 (如100mm)。1.7μm粒径的短柱 (如50mm)适用于UHPLC系统。如何确定合适的筛选梯度时间？梯度时间可以使用公式1计算。VM可用公式2计算。tG = 梯度时间 (mins.) k* = 梯度保留系数 (通常设置约为5)ΔΦ = 梯度范围 (即对于5-95％B梯度，ΔΦ= 0.9) VM = 柱内体积 (mL) S = 5 对于小分子 (＜1000沓)F = 流速 (mL/min) L = 色谱柱长度 (mm) dc = 柱内径 (mm）请务必记住在下一次注射前, 在梯度洗脱后以至少10倍VM (柱内体积) 进行一次等度重新平衡。为何使用色谱柱筛选？ • 改变色谱柱的固定相可能对选择性造成显著影响 (图1)。• 在相同的流动相条件下, 筛选不同的色谱柱可以帮助您以更高的分辨率更快地实现所需的分离。图1：改变色谱柱固定相的影响。色谱柱：50x2.1mm 流动相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v) 梯度：5分钟内3-B，流速：0.06mL/min 温度：40°C 检测：UV，254nm 样品：1）甲硝唑，2）苄醇，3）氢氯噻嗪，4）香草醛，5）羟苯甲酯，6）1,2-二硝基苯 • ACE MDKs将具有不同相互作用机制的色谱柱组合在一起, 以Z大限度地提高选择性并增加分离具有挑战性的混合物的可能性。• 性价比高, ACE MDKs与单支色谱柱价格相同！• 两种Z受欢迎的ACE反相 (RP) MDK (参见下表) 包括了为利用不同的保留机制和Z大化选择性而独特设计的相。• 所有六个相都可以在反相 (RP) 条件下使用, 并且具有与C18一样的稳定性。 1近似值– 通过半定量机制加权和/或通过参考使用>100特征分析物的其他ACE相来确定。 • 其他的ACE方法包还有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和实心核(UltraCore) 分析包• 同样提供微孔柱尺寸 (内径0.5和1.0mm)。成功范例对乙酰氨基酚及有关物质 • 基于分析物的pKa和logD来选择流动相pH值。• 使用MeOH或MeCN作为Z常见的方法开发 (C18）的起点无法分离所有的分析物。所以, 需要进一步的方法开发。• 使用6支色谱柱/2次流动相筛选, 即刻就可识别6种方案。• 无须进一步的方法开发了！条件：色谱柱: 2 μm 100 x 3.0mm流动相:A = 20mM 乙酸胺 pH6.0B = 有机溶液含有 (20mM 乙酸胺 pH6.0):水 (9:1 v/v)梯度：10分钟内5-95%B流速：1.2 mL/min柱温：40 °C进样体积：2 μL样品：1）对乙酰氨基酚 (扑热息痛)2）4-氨基苯酚3）对苯二酚4）2-氨基苯酚5）2-乙酰胺基苯酚6）苯酚7）4-硝基苯酚8）2-硝基苯酚9）4-氯乙酰 ACE反相系统性方法开发方案

2019-06-25 09:06:03蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南十: 蛋白质纯化RP-HPLC 是一种有效的蛋白质/多肽纯化工具。通过 RP-HPLC 法可以从杂质中分离目标蛋白/多肽，采集到的片段可用于进一步研究，以及借助正交分析技术的分析，甚至可作为ZL药物。在蛋白质/多肽分析过程中，色谱条件优化的目标是优化分辨率和保留时间。制备色谱法分离蛋白质/多肽时，色谱条件的开发主要是三个参数的优化（参见图45）：产量是从色谱法每一步中得到的纯化的目标蛋白/多肽含量。高产量可提高纯化过程的实用性，并降低成本。纯度是从目标产物中去除杂质的程度。纯度高有助于从后续分析中获得更佳的数据或获得高纯度产物。通量用来衡量制备周期中纯化的物质量。高通量说明在给定的成本和时间内获得更多研究或分析用物质，或更多原料药，用于制药领域。由于制备色谱的目的与分析色谱的目的不同，因此色谱条件优化也不同。图45. 在蛋白质或多肽的制备纯化中，通过寻求产量、纯度及通量的Z佳平衡实现分离条件的优化。样品装载在分析色谱中，将小样品装载到色谱柱上以确保加样量不影响分辨率。如果样品量过高，则峰会加宽，进而分辨率会下降。在不发生峰展宽的情况下允许加载到色谱柱的样品量（“样品容量”）取决于柱的大小（附录列表显示了柱的大小和样品容量）。制备色谱法纯化蛋白质/多肽时，通常会超出样品容量，使柱“过载”，从而增加产量和通量（图46）。当允许一定的分辨率损失时，加载的样品量可为样品容量的10~50倍（附录，Z大实际负载）。图46中，尽管由于柱过载使得峰变宽，但峰形相对较好，说明严重过载在增加产量的同时还能保持纯度，但目标蛋白/多肽的损失不可避免。由于样品过载，图47中峰也同样加宽。片段收集、分析和利用当柱过载时，通常会抛弃起始峰和结尾峰。图46中，对红色区标示的峰的中间区域进行了收集。去掉了峰首和峰尾。这避免了分离度较差的杂质峰的收集，增加了纯度，但降低了产量。在制备色谱中，对几种感兴趣的峰进行了片段收集，用于杂质分析。图46.在多肽纯化示例中，制备分离包括柱的过载加样，以增加产量。分辨率降低，为了增加纯度必须抛弃峰首和峰尾，但产量稍微有所降低。基于分析结果，收集了少杂质或无杂质的片段，抛弃了峰首和峰尾附近杂质较多的片段。收集和抛弃片段的选择应考虑纯度和产量的平衡。例如，在不损失分辨率的情况下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于纯化少量多肽（Z多约200微克）。但为了增加产量和通量，同样大小的柱Z多可纯化10毫克，但会有一定的纯度或产量损失。恰当的收集峰选择有助于实现纯度和产量间的Z佳平衡。在制备色谱中，尽管ZD在样品质量，但样品体积也可能会很大。尽管可采用样品环和注射器，但通过将样品“泵”至柱上可以注入更多样品。将泵的吸入管置于样品容器内，样品通过洗脱泵加载至色谱柱。当有机溶剂浓度低（通常，样品装在水相中）且目的蛋白/多肽以有机溶剂梯度洗脱时，可通过这种方式装入大量样品。吸附剂粒径分析色谱常用的吸附剂粒径为5μm，制备色谱常用的吸附剂粒径更大。尤其是加样量超过样品容量时（柱过载），柱效较分析色谱影响较小。当柱过载时，大粒径填充柱同小粒径填充柱分离蛋白质和多肽的效果一样。因此，制备色谱常用10μm或以上粒径的吸附剂。粒径分布也往往更宽。不同于0.5μm或更窄的粒径分布范围，制备色谱的粒径范围更大，例如10~15μm。由于制备色谱柱反压和成本更低，因此更倾向于采用大粒子。柱内径由于样品容量很低，纯化过程很少使用小孔柱（内径小于2mm）。小规模实验室纯化采用细孔柱（内径约2mm）和分析柱（4.6 mm内径）。这种小规模制备分离的色谱条件通常与分析分离的色谱条件相同。需要大量蛋白质/多肽时，采用10mm和22mm内径的柱子。1 mg蛋白质或多肽的纯化可采用10 mm柱子，5 mg纯化可采用22 mm柱子。允许柱过载时，可纯化更多蛋白质/多肽，10mm柱Z多可纯化50mg，22mm柱Z多可纯化200mg。大量蛋白质或多肽的纯化采用50 mm、100 mm或内径更大的大内径柱子。50mm内径的柱上已知Z多可纯化5克蛋白质/多肽。柱长与分析柱相比，制备柱往往相对较短。这是因为在制备色谱法中，柱的总体积比柱长更重要，特别是蛋白质的分离。内径60cm、柱长12-15 cm（“圆饼状”柱）的色谱柱已应用到蛋白质ZL药物的大规模纯化中。由于在制备色谱法中，柱通常过载，且效益的重要性远不及产量、纯度及通量重要，因此根据其实用性而非效益优化柱尺寸。流动相组成同分析色谱法一样，采用10~22mm内径柱的小规模纯化常用乙腈-TFA体系。大规模纯化通常采用乙醇等溶剂替代乙腈，采用乙酸替代TFA。尽管采用这些溶剂作流动相会降低分辨率，但它们更适合大规模使用，且分辨率的降低与柱过载固有的分辨率损失相同蛋白质变性通常认为反相色谱法会使蛋白质变性，因此洗脱出来的蛋白质不是天然蛋白，且可能不具备生物活性。尽管反相HPLC的操作条件会使蛋白质变性，但洗脱后仍可获得天然、具有生物活性的蛋白质。有机溶剂可能减弱疏水力，造成蛋白质三级结构的损失。吸附剂的疏水面也可能导致蛋白质的去折叠。但与色谱分离时间相比，蛋白质去折叠通常较慢，且蛋白质在反相色谱分离期间仅发生轻微变性。由于二硫键的作用，蛋白质保持球形结构，且仅发生部分去折叠，因此从反相柱洗脱出的蛋白质通常可通过在恰当的重折叠缓冲液中处理，从而恢复其天然结构而恢复至天然状态。目前有许多实例均显示采用反相HPLC纯化后的蛋白仍维持天然三级结构和生物活性。胰蛋白酶的反相纯化，其中活性得到了保留，且随后用于蛋白质的胰蛋白酶酶切。重组人红细胞生成素是一种成功商业化的蛋白质ZL药物，采用了反相GX液相色谱法将蛋白药物从其细胞培养表达系统中分离出来。采用反相HPLC对另一种商业蛋白质ZL药物——粒细胞刺激因子进行了纯化。此外，还采用反相HPLC对重组人胰岛素进行了纯化，维持了活性结构。纯化实例图47显示了合成肽——促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂的纯化过程。该纯化过程通过以下几个步骤展开：在4.6 x 250 mm 的分析柱上构建洗脱条件。在50 x 300 mm 的柱上装载1.2克合成肽混合物，基于diyi步构建的条件洗脱（图47）。对 GnRH 拮抗剂各洗脱峰的片段进行收集并借助分析法分析，Z终实现Z高产量和纯度。用乙腈和TFA作为洗脱剂，在反相色谱柱上再次进行色谱分析,完成收集到片段的脱盐处理。收集片段实现Z高产量和纯度。在该色谱纯化步骤中，从1.2 gm的反应混合液中可收集128 mg的纯化肽。该纯化过程采用了与分析色谱分离相同的有机溶剂——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。由于柱过载，洗脱峰更宽，分辨率不如分析色谱。但峰仍然较为紧密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脱液。图47. 128mg的合成肽——促性腺激素释放激素的纯化。柱严重过载，导致峰非常宽。条件色谱柱：C18宽孔柱，15~20μm粒径，50 x 300 mm。流动相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脱。样品：促性腺激素释放激素

2019-06-24 09:01:16蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南九: 二硫键测定蛋白质依靠正确的二硫键键合维持其三级结构和生物活性。如果二硫键被还原或交换，则蛋白质会失去天然三级结构和生物活性。 HPLC保留值取决于蛋白质“疏水脚”的大小（图41），它会受到三级结构的影响。二硫键的改变通常会使“疏水脚”增大，从而使蛋白质在反相HPLC中的保留值增大。图42中，天然白细胞介素II的出峰远远早于被还原的白细胞介素II，这是由于当二硫键被还原时，蛋白质的三级结构发生了改变。图41. 蛋白质保留值取决于“疏水脚”的大小。被还原的二硫键会使蛋白结构发生部分变性，这将增大“疏水脚”和反相保留值。图42. 随着二硫键的还原，白细胞介素II的“疏水脚”会增大，从而增加蛋白质在反相HPLC上的保留值。条件色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米流动相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速进行90分钟的梯度洗脱样品：白细胞介素II突变蛋白质图43. 对二硫键合正常和发生二硫键交换的类胰岛素生长因子的分离。条件色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米流动相：20~38% 乙腈：异丙醇（88:12）—0.1% TFA体系，梯度洗脱，27分钟。即使是细微的二硫键改变也足以对疏水脚产生影响，从而改变保留值。天然类胰岛素生长因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之间都有二硫键（图43A红色部分所示）。经过36小时的空气氧化，一些IGF蛋白分子内出现了二硫键交换，变成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6间的二硫键键合（图43A蓝色部分）。发生了二硫键交换的IGF比天然IGF出峰晚（图43），表明了疏水脚的增大。天然蛋白的反相色谱法通常以反相保留值的变化揭示二硫键或蛋白三级结构的改变。在蛋白酶水解蛋白过程中（通过省去DTT和羧甲基化过程），如果二硫键未被还原，则肽图中仍会包含二硫键合的二肽。分别比较二硫键未还原和还原的肽图能够确定二硫键的位置。在二硫键还原和未还原条件下水解白细胞介素II，通过RP-HPLC法得到两种水解产物的肽图（图44）。图44A中，以T7+T10标记出的肽是一种二硫键合的二肽。在二硫键被还原的条件下得到的肽图显示了两种肽，分别为T7和T10（图44B）。这证实了二硫键存在于这两种肽之间。监测蛋白质水解产物肽能够确定各个二硫键在蛋白质中的位置。如果一个胰蛋白酶肽段内存在两个半胱氨酸，则必须利用另一种蛋白酶确定参与到二硫键中的半胱氨酸。通常将肽图分析和质谱法联用确定二硫键的位置和状态。图44. 分别比较二硫键未还原（A图）和还原（B图）情况下白细胞介素II的肽图。条件色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米流动相：5~80% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，99分钟。样品：A二硫键未还原情况下白细胞介素II的肽图。B二硫键还原情况下白细胞介素II的肽图。

2019-06-21 09:25:19蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南八: 脱酰胺作用 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南蛋白质在高温或高pH值下会降解。在胁迫条件下，Z有可能发生的化学降解是酰胺侧链上的天冬酰胺转变为天冬氨酸或异天冬氨酸（图37)。天冬酰胺脱去酰氨基时，许多蛋白都会失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影响。即使脱酰胺作用不造成生物活性的减弱，脱酰胺作用也是蛋白接触不利条件的指示。特定天冬酰胺残基脱酰胺的可能性取决于其在蛋白质三级结构中的位置。只有那些与溶剂接触表面接近的天冬酰胺残基才会发生脱酰胺作用。相邻的氨基酸残基同样影响脱酰胺作用的可能性。与天冬酰胺相邻的甘氨酸极大地增加了脱酰胺作用的可能性。与天冬酰胺相邻的亮氨酸和异亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脱酰胺作用的可能性。由于脱酰胺作用会影响生物活性并能指示不利条件，因此惯常的做法是监测蛋白质ZL药物中天冬酰胺的脱酰胺作用。图37. 当酰胺侧链暴露在高温和/或高pH条件下时，天冬酰胺转化为天冬氨酸。图38. 人生长激素脱酰胺作用的反相色谱分析条件色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米流动相：29% 异丙醇，71% 10 mM Tris盐酸缓冲液、pH=7.5这通常由反相GX液相色谱法实现。图38显示了通过完整蛋白分子的反相色谱法测量人生长激素的脱酰胺作用的一个试验。该试验pH为7.5，以使脱酰胺作用产生的天冬氨酸电离。这使得脱酰胺的生长激素相较于天然蛋白疏水性减弱，从而比天然蛋白先洗脱出来。更常见的一种方法是通过肽图中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留时间来测定脱酰胺作用。在pH为2的肽图中，含有天冬氨酸的脱酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略强，因此比天然肽略晚洗脱出来，如图39所示。脱酰胺肽容易鉴别测定，为脱酰胺作用的判定提供了较好的方法。图39. 部分脱酰胺的核糖核酸酶的肽图条件色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米流动相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，100分钟。有时，脱酰胺肽较难从天然肽中分离或会在肽图中出现与其它肽的共洗脱峰。如果分辨率不足，则可以增加pH。如图40所示，在低pH值下分离较差的脱酰胺肽能够在6.5的高PH值下从天然肽中有效分离。在部分脱酰胺的人生长激素的低pH肽图中（图40A），脱酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但与肽图中的另一种肽未分离。对肽峰进行收集后以更高的pH（pH6.5）重新进行色谱分离。在高pH值下，脱酰胺肽中的天冬氨酸被电离，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（图40B）。图40. 部分脱酰胺的人生长激素的肽图中脱酰胺肽从天然肽的分离。A pH=2时，部分脱酰胺的hGH的肽图（0.1% TFA）B 收集含天然肽（顶部）和脱酰胺肽（底部）的肽图A中的肽段，在6.5的pH下重新进行色谱分析。色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米A. 流动相：乙腈-0.1% TFA体系梯度洗脱，pH 2.0B. 流动相：乙腈-30 mM 磷酸钠体系梯度洗脱，pH 6.5