- 2025-05-15 05:52:44单细胞分选
- 单细胞分选是一种用于分离和筛选单个细胞的技术。它基于细胞的物理或化学特性,如大小、形状、表面标记等,利用微流控技术或激光等方法,实现单个细胞的精确操控和分离。该技术广泛应用于生物医学研究、疾病诊断、药物筛选等领域,对于深入理解细胞异质性、探索疾病机制、发现新的治疗靶点具有重要意义。
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单细胞分选问答
- 2023-03-07 22:09:15高通量单细胞力谱测定!多功能单细胞显微操作技术助力单细胞力学研究
- 单程细胞具有复杂生物学性质,它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接,诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先,由于细胞与基质的作用力仅为nN级别,因此需要力学精度较高的设备才能够测量,而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜(AFM)。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制,需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起,这个过程十分繁琐,并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值,无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。而多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状,它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞,取得和AFM近似精度的数据,无需在探针上进行任何修饰,不会改变细胞表面的任何通路,从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞,具备很高的自动化,能够快速测量细胞粘附力。使用FluidFM对细胞操作的基本流程 FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示,FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端,通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离,并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力,评估细胞群体分布以及细胞间差异,并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最佳测量时间导致的细胞粘附力改变,得到更为精准的结果。近期,Agoston等人使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM实现了高通量细胞粘附力测量,对同种细胞不同区以及不同细胞之间的粘附力进行测量和比较。作者首先对Vero和Hela细胞在不同状态下的粘附力进行了测量和比较,总共测量了214个细胞。通过比较明胶涂层上处于单个细胞、孤岛状细胞、致密连接细胞以及单层细胞上游离细胞之间的粘附力,能够明显观测到Vero细胞处于致密连接的细胞粘附力最大,大概在750 nN左右,随着细胞单细胞层的稀疏,细胞粘附力有所下降,而处于细胞层顶部的细胞粘附力最低仅为50 nN左右。这一点充分说明上皮细胞能够在细胞之间形成紧密的连接,而处于细胞层外的细胞则几乎没有粘附力。而对于HeLa这样的肿瘤细胞测量的结果却显示出了截然不同的结果,处于不同状态的细胞有着近似的粘附力,基本都在200 nN左右,这与处于单个游离上皮细胞的粘附力十分接近,表明HeLa细胞在不同环境下仍然具有较高迁徙能力。使用FluidFM对不同区域细胞的FD曲线测定结果和对比 通过对这两种细胞的最大粘附力、最大粘附能量、最大拉伸距离和细胞接触面积进行统计分析可以发现,HeLa肿瘤细胞在粘附力和粘附能量上均有所降低,但是当HeLa细胞形成了单层后,两者区别不大。对比Hela和Vero在不同生长状态下的最大粘附力、最大粘附能量、粘附拉伸距离和粘附面积。再进一步对Vero与HeLa细胞最大粘附力与距离和接触面积进行对比,依然可以得到与单独比较粘附力相同的结果,并且最大能量与细胞接触面积的比值中也存在着类似的结果。由此可见肿瘤细胞通过降低自身粘附力从而获得了更好的迁移能力。对不同状态Vero和A549之间的粘附力/粘附距离、粘附力/粘附面积、粘附能量/粘附面积 总结 细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用,然而传统手段中有着各种各样的局限性,主要原因是缺乏一种有效抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM技术在细胞粘附力测定中的应用,使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞,配合原子力显微镜精确测量的特性,真正意义上做到精准、无损、快速的测量单细胞粘附力,帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。 【参考文献】[1] A. Sancho, M. B. Taskin, L. Wistlich, P. Stahlhut, K. Wittmann, A. Rossi & J. Groll. Cell Adhesion Assessment Reveals a Higher Force per Contact Area on Fibrous Structures Compared to Flat Surfaces. ACS Biomater. Sci. Eng. 2022, 8, 2, 649–658.[2] P.W. Doll, K. Doll, A. Winkel, R. Thelen, R. Ahrens, M. Stiesch & A.E. Guber. Influence of the Available Surface Area and Cell Elasticity on Bacterial Adhesion Forces on Highly Ordered Silicon Nanopillars. ACS Omega. 2022, 7, 21, 17620–17631.[3] Sankaran, S. Jaatinen, L. Brinkmann, J. Zambelli, T. Vörös, J. Jonkheijm, P. Cell adhesion on dynamic supramolecular surfaces probed by fluid force microscopy-based single-cell force spectroscopy. ACS Nano 2017, 11, 3867–3874.[4] Sancho, A. Vandersmissen, I. Craps, S. Luttun, A. Groll, J. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci. Rep. 2017, 7, 46152.[5] Ines, Lüchtefeld. Alice, Bartolozzi. Julián M. M. Oana, Dobre. Michele, Basso. Tomaso, Zambelli. Massimo, Vassalli. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. J Nanobiotechnol. 2020, 18, 147.[6] Dehullu, J. Valotteau, C. Herman-Bausier, P. Garcia-Sherman, M. Mittelviefhaus, M. Vorholt, J. A. Lipke, P. N. Dufrene, Y. F. Fluidic force microscopy demonstrates that homophilic adhesion by Candida albicans Als proteins is mediated by amyloid bonds between cells. Nano Lett. 2019, 19, 3846–3853.[7] Mittelviefhaus, M. Müller, D. B. Zambelli, T. Vorholt, J. A. A modular atomic force microscopy approach reveals a large range of hydrophobic adhesion forces among bacterial members of the leaf microbiota. ISME J. 2019, 13, 1878–1882.[8] F. Weigl, C. Blum, A. Sancho & J. Groll. Correlative Analysis of Intra- versus Extracellular Cell Detachment Events vis the Alignment of Optical Imaging and Detachment Force Quantification. Adv. Mater. Technol. 2022, 2200195.【相关产品】 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM:https://www.yiqi.com/zt2203/product_386418.html
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- 2023-02-24 11:28:18高通量、自动化单细胞力谱测定!多功能单细胞显微操作全新技术助力单细胞力学研究
- 研究现状单程细胞具有复杂生物学性质,它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接,诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先,由于细胞与基质的作用力仅为nN级别,因此需要力学精度较高的设备才能够测量,而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜(AFM)。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制,需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起,这个过程十分繁琐,并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值,无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。多功能单细胞显微操作FluidFM技术多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状,它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞,取得和AFM近似精度的数据,无需在探针上进行任何修饰,不会改变细胞表面的任何通路,从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞,具备很高的自动化,能够快速测量细胞粘附力。使用FluidFM对细胞操作的基本流程FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示,FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端,通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离,并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最 大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力,评估细胞群体分布以及细胞间差异,并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最 佳测量时间导致的细胞粘附力改变,得到更为精 准的结果。
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- 2023-06-09 11:41:52人人都是流式高手:Tumor-infiltrating lymphocytes(TILs) 分选秘籍
- Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸润肿瘤组织的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分,负责识别和攻击异常细胞,包括癌细胞。流式细胞术对TILs的分选提供了一个重要的工具,用于表征、纯化和研究浸润肿瘤的免疫细胞群。它有助于研究人员了解TILs的组成、功能和潜在的治 疗相关性,推动我们对肿瘤与免疫相互作用的理解。我们使用流式细胞术来分选TILs主要应用场景如下:01、鉴定和表征:流式细胞术允许我们根据TILs表面标记物的特征来鉴定和表征不同的亚群。通过使用针对CD3、CD4、CD8和其他免疫细胞标记物的特异性抗体来标记细胞,我们可以区分和定量TILs中的各种T细胞亚群。这有助于我们了解肿瘤微环境中TILs的组成和多样性。02、特定TIL亚群的纯化:流式细胞术分选使我们能够分离和纯化感兴趣的特定TIL亚群。通过基于表面标记物的表达,对细胞进行分选和筛选,我们可以收集纯净的TIL亚群用于进一步的下游应用。这使研究人员能够研究特定的TIL亚群,并研究其功能特性或基因表达谱。03、功能分析:分选后的TILs可用于功能性分析,以评估其免疫活性和功能。例如,可以测试分选后的TILs的增殖能力、细胞因子产生、对肿瘤细胞的细胞毒性或其他功能性实验。这些分析提供了有关TIL亚群功能能力和潜在抗肿瘤免疫反应的见解。04、基因组学或蛋白质组学分析:流式细胞术分选可以获得纯净的TIL细胞群,进而进行基因组学或蛋白质组学分析。通过分析分选TILs的基因表达或蛋白质谱,研究人员可以更深入地了解与TILs在肿瘤免疫中相关的分子机制和信号通路。然而不同于外周血、脾 脏中的淋巴细胞,TILs的流式检测存在更多的不确定性,需要有效优化包括样本处理、配色方案、上样条件以及分析方法等实验设计的各个方面,才能实现更为准确、真实的多色复杂样本流式检测。图1为外周血来源样本淋巴细胞分型的流式检测数据,由图可见,淋巴细胞群体T、B细胞分群明显,T细胞亚群也可清晰区分。另外,我们也可以看到,该数据以FSC通道设定阈值,其阈值设定值较低,导致碎片及噪音信号干扰明显,不过由于血液样本碎片较少,与细胞分群明显,故而对最 终结果的影响并不大。图1 血液样本淋巴细胞免疫分型流式数据然而,当我们使用同样的模板检测肿瘤组织样本时,数据就出现了明显问题。实体瘤组织细胞构成复杂,并且在将组织样本制备成单细胞样本的过程中会产生大量的细胞碎片,这些杂质细胞及碎片会对流式检测造成显著的干扰。如图2所示,T细胞中出现了大量CD19和CD3双阳性细胞,不符合已有文献报道的结果。这些双阳性细胞主要是由于杂质细胞及碎片的非特异干扰导致的。这些干扰对于流式检测及流式分选的准确性有很大影响,甚至会导致得出错误的结论。图2 浸润肿瘤组织的淋巴细胞免疫分型流式数据那么,基于以上数据,我们应该如何优化实验设计以提高浸润肿瘤组织的淋巴细胞分选的准确性呢?这里给大家以下几点建议:01、增加Pan-Marker检测:这里的Pan-Marker是指目标细胞群均表达,但其他细胞群体及碎片不表达的表面标记。CD45广泛表达于免疫系统的各个细胞亚群上,但在非免疫细胞上没有表达或表达很低。因此,在检测淋巴细胞等免疫细胞时,可通过检测CD45是否表达来区分免疫细胞及非免疫细胞,以达到排除杂质细胞干扰的目的。02、优化样本制备方案:对复杂样本来讲,样本制备方案是否合适决定了流式实验的成功率。可根据文献报道并通过预实验来选择最 佳的消化酶配方和消化时间,在确保细胞得率的同时尽量减少杂质干扰并最 大限度的保存细胞活性及功能。此外,选择合适的细胞分离手段进行目的细胞的富集。例如,若针对淋巴细胞检测,利用Ficoll或Percoll密度梯度离心法富集单个核细胞,可有效去除脂肪、碎片及杂质细胞的干扰。03、进行Fc封闭:组织浸润的多种细胞,特别是单核/巨噬细胞以及DC细胞高表达抗体Fc端的受体。这些细胞在进行流式抗体标记时,即使不表达相关抗原,也可通过Fc受体非特异性的结合流式抗体的Fc端,从而导致非特异信号。要解决这一问题,可购买商业化Fc封闭试剂,在标记流式抗体前进行Fc封闭即可。04、合理设定阈值:阈值的设定与实验目的息息相关。在流式分析实验中,应当设定阈值去除绝大部分噪音及碎片信号,仅保留少量碎片信号即可。在流式分选实验中,若分选所得细胞用于培养,同样应当设定阈值去除绝大部分噪音及碎片信号,仅保留少量碎片信号,这样做可以有效提高分选效率及回收率;但若分选所得细胞用于qPCR、测序,特别是单细胞测序等基因组学应用,由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至细胞核碎片,在分选过程中就需要将尽可能多的碎片与目的细胞区分,因此应当设定较低的阈值以暴露足量的碎片信号让分选仪器检测到,进而有效确保分选所得目的细胞不掺杂核酸碎片,以免影响后续实验准确性。05、利用空白荧光通道排除非特异:什么是空白荧光通道呢?举一个例子,我们设计一个3色实验标记FITC、PE、PE-Cy7三种染料,没有标记APC,在检测时APC通道就是空白通道,是不应该有阳性信号的。复杂样本中的部分杂质细胞有较强的非特异荧光信号,通常这些非特异的荧光信号在所有的流式荧光通道中均可检测到。基于这一原理,我们可在上样时预留一到两个空白荧光通道,样本中的目的细胞没有标记这些空通道的荧光素,在这些通道里面是阴性的,而杂质细胞的非特异信号在空白通道中通常也是阳性的,我们就可以通过设门选择空白通道中的阴性细胞来达到去除非特异信号的目的。需要注意的是,利用这一方法时要充分考虑补偿的影响,最 好选择与已用通道补偿小或无补偿的通道作为空白通道。06、增加细胞死活染料:死细胞的非特异性地结合会增加假阳性。死细胞会产生自发荧光干扰特定信号的检测。在TILs分选中去除死细胞。可以增加数据准确性:死亡的细胞可能会释放细胞碎片和细胞内成分,这可能会干扰实验结果,引入假阳性或假阴性结果。通过去除死细胞,可以提高分选结果的准确性和可靠性。并且为分选后TILs细胞活力提供保证:分选到活细胞可以保证后续实验的有效性和可靠性。死亡细胞不具备正常的生物活性和功能,因此分选到活细胞可以确保后续实验能够反映真实的细胞生物学状态。图3 无死细胞排除处理的样本分析比较图4 有死细胞排除处理的样本分析比较复苏后的PBMC在免疫染色之前不添加(图 3)或者添加ViaKrome 405可固定活性染料(55℃,10分钟)(图 4)。然后,使用Perfix-nc细胞染色试剂盒(型号 B10825)处理细胞,并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 进行染色。 数据统计信息显示:两个不同条件下,门内细胞在上一门级百分比也不一样,充分展示了消除死细胞以后的数据效果。
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- 2023-07-03 11:42:58人人都是流式高手:GFP分选,这还有我不会的?
- 很常见的场景如下:细胞转染后,想用流式检测表达GFP细胞的百分比并且分选,但是不同的设门方法让GFP阳性细胞百分比看起来有差异,究竟下面哪种策略才适合呢?今天我们主要讨论一下FSC和SSC上设门对GFP阳性细胞百分比的影响。让我们一个一个设门,把每种情况具体看一下。保持FITC通道上的门不变,我们来看一下在前向和侧向的散点图上设门在不同的位置,代表你选择了什么类型的细胞。只有P1赋予了蓝色,其他门的颜色去掉,这样,我们就可以很方便的看出来细胞群在不同的图上所处的位置。第 一种设门,除了左下角靠近0的碎片不圈,其他基本都圈上,从第二张SSC-A和SSC-H排粘连的散点图可以看出来有单个细胞也有粘连细胞,P2门下 GFP阳性细胞百分比为61.36%。第二种设门,只圈最密集的这一群,从第二张SSC-A和SSC-H排粘连的散点图可以看出来,这部分的细胞基本都是单个的,P2门下 GFP阳性细胞百分比为65.39%,较第 一种高。第三种设门,密集细胞群左边的和左下角靠近0的碎片不圈,只圈右边的这两群,从第二张SSC-A和SSC-H排粘连的散点图可以看出来有单个细胞也有粘连细胞,P2门下 GFP阳性细胞百分比为65.70%,较第 一种高,和第二种差不多,但是稍微高一点。这样分析下来,大家最 大的困惑是这三群细胞要不要圈,怎么圈才是最 好的?让我们在第 一张FSC和SSC的散点图上根据细胞群设三个门。三个门分别为P1、P4和P5,显示了三种不同的细胞群。P1显示为单个细胞,FITC通道上阳性细胞比例为65.54%。P4显示大部分为粘连的细胞,因此在FITC通道上的阳性细胞比例为71.43%,较P1细胞群高,如果分析时加入这群细胞会增加GFP阳性细胞百分比。如果在单克隆分选中选择这群,会导致虽然筛选到阳性细胞,但是单克隆源性降低。P5显示为单个细胞,但是因为FSC较P1小,考虑是细胞状态不好细胞呈现皱缩导致,所以其在FITC通道上的阳性细胞比例为20.15%,较P1细胞群低的多,如果分析时加入这群细胞则会降低GFP阳性细胞百分比。如果加入7AAD染料,这群会呈现出阳性,所以在分选中这群细胞不该圈选,或者在去除死细胞的门中去除。由此可见,如果只想要分析状态好的单个细胞的GFP阳性百分比,那你可以选择P1门的设门方式,当然也可以把P1和P4都选上,再用SSC-A和SSC-H去掉粘连细胞对数据的干扰。练习题如果您在细胞转染后,流式检测表达mCherry细胞的百分比时发现,mCherry通道细胞群并没有呈现明显分开的两群(由于细胞在mCherry通道有较高的自发荧光),要怎么确定mCherry细胞百分比并且分选呢?
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- 2023-05-20 12:59:12测定单克隆细菌群体中单细胞对抗生素的敏感性
- 鉴于抗菌素耐药性的出现,了解细胞群体对抗生素反应的异质性至关重要。因为药物可以施加选择压力,导致抗性表型的出现。迄今为止,无论是整体方法还是单细胞方法都无法将单细胞易感性的异质性与人群对抗生素的反应联系起来。在这里,我们提出了一个平台,通过使用锚定微流体滴和图像和数据分析管道,测量单个大肠杆菌细胞在不同环丙沙星浓度下形成小菌落的能力。微流控结果与抗生素敏感性的经典微生物学测量结果进行了基准测试,显示池微流控芯片与重复的批量测量结果之间的一致性。此外,单细胞形成菌落的实验可能性用于提供概率抗生素敏感性曲线。除了概率观点外,微流控格式还可以随着时间的推移对大量单个细胞的形态特征进行表征。该管道可用于比较不同菌株对具有不同作用机制的抗生素的反应。
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