如今，监管机构越来越关注分析方法生命周期的管理，如何将已有方法现代化，包括如何提升常规分析系统性能和色谱柱技术，是许多受监管实验室面临的挑战。对于制药实验室，虽然几年前验证的方法依然有效，但其实仍存在评估和改进的需求，因为追求更快、更稳健、更灵敏、更经济的技术替代始终是现代化实验室高效运营的关键。
为了满足这些需求，推出了专用于生物制药实验室的新一代高效液相色谱系统Alliance? iS Bio HPLC System。它采用生物惰性流路和MaxPeak? HPS高性能表面技术，消除常规生物制药分析流程中金属敏感化合物的不可预测性，并且耐受苛刻的流动相条件，是生物分子分离分析的可靠伙伴。
图1.配置紫外检测器的Alliance iS Bio HPLC System。
本文中，我们将美国药典(USP)<129>通则中的SEC方法成功迁移到Alliance iS Bio HPLC System上，并评估了SEC方法现代化所带来的益处。结果表明，采用Alliance iS Bio HPLC System，不仅可以显著降低溶剂消耗、缩短方法运行时间，并且与传统HPLC系统相比，Alliance iS Bio还提高了对于聚集体、片段等杂质的分辨率和灵敏度。
药典SEC方法的现代化显著减少分析时间和流动相的消耗；
Alliance iS Bio HPLC System的生物兼容性和生物惰性非常适合用于高离子强度流动相的SEC蛋白分析。
美国药典USP <621>通则中，允许修改各论中对于色谱流速、色谱柱规格和填料粒度，方便分析科学家在法规允许变更的框架下，充分运行现代HPLC技术来提高方法性能，而无需对调整后的方法进行重新验证。
首先，我们参照USP<129>通则体积排阻色谱法(SEC)，采用5 μm填料的色谱柱，进行单抗的标准分析；而后，将该方法迁移至Alliance iS Bio HPLC System，并与传统HPLC系统进行结果比较，以评估方法水平；并且，我们在满足USP<621>的指导原则下，对该药典方法进行调整，并评估了与原系统相比，现代化方法在性能和通量方面的提升。
现代化 方法#1 | 现代化 方法#2 | ||
Alliance iS Bio HPLC | Alliance iS Bio HPLC | ||
色谱柱 | BioSuite? Diol (OH) Column, 250 ?, 5 μm, 7.8 mm x 300 mm, (p/n: 186002165) | XBridge? Premier Protein SEC Column, 250 ?, 2.5 μm, 7.8 x 150 mm, (p/n: 186009961) | XBridge Premier Protein SEC Column, 250 ?, 2.5 μm, 4.6 x 150 mm +eConnect, (p/n: 186009959RF) |
进样体积 | 20 μL | 10 μL | 3.5 μL |
流速 | 0.50 mL/min | 1.00 mL/min | 0.35 mL/min |
流动相 | 0.20 M potassium phosphate and 0.25 M potassium chloride，pH 6.2 | 0.20 M potassium phosphate and 0.25 M potassium chloride，pH 6.2 | 0.20 M potassium phosphate and 0.25 M potassium chloride，pH 6.2 |
运行时间 | 30 min | 7.5 min | 7.5 min |
色谱数据系统 | Empower 3, FR4 | Empower 3.8.0 | Empower 3.8.0 |
方法迁移
使用Alliance iS Bio HPLC System配备的智能方法转移APP(iMTA)，可简化方法转移过程。如图2所示，iMTA支持转换来自不同系统的方法，仅需几次点击，即可自动将泵、样品管理器、色谱柱管理器和检测器的关键参数转换为Alliance iS Bio HPLC System仪器方法，避免参数转移错误的风险，随后执行运行、保存方法，并生成方法转移文档用于数据追溯。
图2.iMTA支持无缝转移来自其他HPLC系统的方法条件，并将参数自动转换为Alliance iS Bio HPLC System的方法。
以USP<129>为标准，使用L59, 5-micron, 7.8 mm x 300 mm色谱柱在传统HPLC系统上运行方法，再用iMTA将方法迁移到Alliance iS Bio HPLC System上，如图3展示，两种系统的色谱结果具有一致性，均可满足药典系统适用性标准，但是在Alliance iS Bio上，我们观察到单体主峰和杂质峰之间的分辨率有所提升，显示出在现代化方法中使用低扩散的Alliance iS Bio HPLC System运行SEC方法的优势。
图3.A) SEC分离USP单抗分别在传统HPLC和Alliance iS Bio HPLC System上采用药典SEC方法分析单抗药物。B)两种仪器上n=7次进样的系统适用性结果。C)两种系统上低分子量杂质的回收率比较。
方法现代化
现代实验室面临提速增效和方法周期管理的挑战，需要在法规支持的框架下寻求方法调整和现代化。作为下一代高效液相色谱系统，Alliance iS Bio HPLC System创新的设计广泛兼容不同体系方法和色谱柱规格，助力提高方法通量和效率，以实现方法现代化的要求。
我们选用两种不同规格SEC色谱柱将USP<129>方法现代化，它们保持了与原始方法相同的柱效。图5显示了利用色谱柱计算器，可以快速有效地进行色谱柱参数缩放。
图5.色谱柱计算器用于缩放色谱柱方法参数，以保持长度与粒度比(L/dp)满足药典要求。
我们将Alliance iS Bio HPLC System的数据与传统HPLC系统在药典方法下产生的数据进行比较，结果如图6和7所示，不同色谱柱和方法有其独特的优点，我们可以根据特定的分析需求选择匹配的方法。
图6所示，在Alliance iS Bio HPLC System上，采用7.8 mm ID的SEC柱（蓝色谱图），可缩短4倍的方法运行时间，从30分钟到7.5分钟。同时，该方法具有三种方法中最高的分辨率，能够分辨出在传统HPLC系统上无法检测到的LMWS峰。结果表明在Alliance iS Bio HPLC System上运行7.8 mm ID的SEC方法具有更理想的分辨率，有助于有关物质的准确定量。
图6.在传统系统和Alliance iS Bio HPLC System上分离USP mAb 003参考标准品的对比结果。
在图7中，分析不同的USP mAb对照品，我们再次看到两种方法与药典方法具有一致的选择性。同时，在Alliance iS Bio HPLC System上采用4.6 mm ID的SEC柱（红色谱图），与药典方法相比，流动相和样品消耗可减少6倍。该方法为SEC分析提供了更低的运行成本，是降本增效的理想之选。
图7.在传统系统和Alliance iS Bio HPLC System上分离USP mAb 002参考标准品的对比结果。
监管机构鼓励实验室通过采用现代技术取代传统技术，在分析工作流程中探索方法的现代化。实验结果表明，Alliance? iS Bio HPLC System能够顺利地迁移药典SEC方法并将其现代化，以适应生物药实验室当前和未来的工作流程。将Alliance iS Bio HPLC System与XBridge Premier Protein SEC色谱柱结合使用，可以提高杂质分辨率，同时减少75%的分析时间和82.5%的流动相消耗。Alliance? iS Bio HPLC System还配备智能方法转移APP，简化工作流程，顺利的建立稳健的方法，助力分析科学家在生物制药领域一展身手。
Modernizing Compendial SEC Methods for Biotherapeutics Using the Alliance? iS Bio HPLC System | Waters
4. Kizekai L, Shiner SJ, Lauber MA. Waters ACQUITY and XBridge Premier Protein SEC 250 ? Columns: A New Benchmark in Inert SEC Column Design. Waters Application Note. 2022. 720007493.
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