液滴微流控（四）：在液滴中培养大肠杆菌

已有研究表明，使用氟化油进行油包水液滴制备，可用于长期细胞培养[1]，相较矿物油，氟化油表现出更好的生物相容性[2]，但要找到一种有效稳定液滴的表面活性剂，仍是一个挑战。本研究的目的是：通过在液滴中培养大肠杆菌（Escherichia coli），说明新型表面活性剂dSURF的生物相容性及液滴稳定表现。

此研究由Dr Oksana Shvydkiv在其实验室（Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. （超链接https://www.leibniz-hki.de/en/institut.html））完成。

材料及设备

1.      连续相试剂：含0.5%或3%的dSURF（Fluigent）氟化液Novec HFE-7500（Sigma Aldrich）。

2.分散相试剂：500μl OD600值为0.005（5 x 106 CFU/ml）或0.01（10 x 107 CFU/ml）的大肠杆菌悬浮液ECJW922。（CFU，colony forming unit，菌落形成单位；OD，Optical Density，光密度）

3.液滴制备解决方案：液滴PDMS芯片由研究者自行设计，液滴制备解决方案为Fluigent所提供的液滴制备系统（见下图），主要部件包含压力泵FLOW EZ（压力泵流量控制稳定）、流量传感器。

实验过程简述：压力泵FLOW EZ将试剂泵至液滴芯片，以生成液滴；PC端AIO软件监测并控制流量，以达到合适的液滴大小及生成频率。

液滴监测

为监测液滴的稳定性并观察大肠杆菌的生长状况，将液滴转移至微流控芯片观察室，于倒置显微镜（Axio Observer Z1, Zeiss)上进行观察，所用物镜放大倍数为10倍，使用PCO相机在开始培养的2小时，4小时和20小时后进行图像采集。

培养结果

使用OD600=0.005大肠杆菌悬浮液，0.5% dSURF表面活性剂，在37℃温度下的培养结果：

（A）培养4h后的明场液滴图像；（B）培养20h后的明场液滴图像

（C）培养4h后的暗视液滴图像；（D）培养20h后的暗视液滴图像

观察上图，可明显观察到稳定的单分散液滴，含大肠杆菌的液滴数量占比为46±0.8 %，理论计算值为54%（液滴尺寸为67.3μm，160pL）。它们之间的差异可以解释为实验过程中出现的一些小误差，如吸取试剂不极ng确。

使用OD600=0.01大肠杆菌悬浮液，0.5% dSURF表面活性剂，在37℃温度下的培养结果：

（A）培养4h后的明场液滴图像；（B）培养20h后的明场液滴图像

（C）培养4h后的暗视液滴图像；（D）培养20h后的暗视液滴图像

于上图可明显观察到稳定的单分散液滴，含大肠杆菌的液滴数量占比为89±1 %，理论计算值为86%（液滴尺寸为72.4μm，200pL）。

使用OD600=0.005大肠杆菌悬浮液，3% dSURF表面活性剂，在28℃温度下的培养结果：

（A）培养4h后的明场液滴图像；（B）培养20h后的明场液滴图像

（C）培养4h后的暗视液滴图像；（D）培养20h后的暗视液滴图像

由上图可明显观察到稳定的单分散液滴，含大肠杆菌的液滴数量占比为63±1.1 %，理论计算值为63%（液滴尺寸为72.4μm，200pL）。

结论

根据上述观察到的大肠杆菌培养结果，表明dSURF表面活性剂在浓度为0.5%至3%的情况下具有良好的生物相容性，对于常规应用，使用0.5%浓度的dSURF即可，成本较3%浓度dSURF更低。在大肠杆菌培养20小时后，液滴表现出的良好的稳定性，表明dSURF表面活性剂可用于长时间液滴实验。

参考文献：

[1]. C. H. J. Schmitz, A. C. Rowat, S. Koester and D. A. Weitz, Dropspots: a picoliter array in a microfluidic device, Lab Chip, 2009, 9, 44–49.

[2]. Lee JN, Park C, Whitesides GM. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Anal Chem 2003, 75:6544-54.