干货 | 基因编辑探秘系列之在细胞与基因治疗领域的应用

2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因编辑疗法产品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）获英国药品监管机构MHRA有条件批准上市，用于治疗治疗镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β-地中海贫血（TDT），是全球首款获批上市的CRISPR基因编辑药物，12月8日，美国食品和药物管理局（FDA）也批准了该基因编辑治疗药物。这是基因编辑治疗历史上的里程碑事件，代表着一项重大的科学进步可以让数以万计的患者受益。

图1. CASGEVY™治疗流程（Source：CRISPR Therapeutics官网）

自2012年首次亮相以来，CRISPR技术已在基因功能研究、药物靶点筛选、遗传疾病治疗、癌症研究以及作物育种等多个领域取得突破性成果。其工作机制如下：

Cas蛋白（如常用的Cas9）在gRNA的引导下定位到目标DNA序列，随后Cas9与DNA结合并切割其双链，产生一个双链断裂（DSB）。细胞为了修复这一断裂，将启动自身的修复机制，如非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）。通过这些修复过程，可以在目标DNA中引入特定的序列。

目前CRISPR技术能以前所未有的精确度对DNA进行修改，包括添加、删除或替换特定基因片段，这一进步不仅使基因修复更加便捷和精准，也为基因治疗指明了新的发展方向。基于CRISPR技术的基因治疗主要分为体外和体内两种形式，下面将为大家详细介绍。

图2. 体外与体内基因编辑疗法^[1]

体外CRISPR基因编辑疗法主要包括从患者身上收集细胞、在体外进行进行CRISPR基因编辑、将编辑后的细胞移植回患者体内等流程，上述介绍的CASGEVY™便是典型的体外CRISPR基因编辑疗法。除了直接利用CRISPR技术纠正导致癌症的基因突变外，该技术在癌症治疗领域的另一关键应用是免疫细胞的工程化改造，如创建嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）、通用型CAR-T（UCAR-T）等抗癌免疫疗法。

CAR-T疗法是通过改造患者自体T细胞，使T细胞表面表达针对特定癌症抗原的嵌合抗原受体（CAR），通过CAR特异性识别体内肿瘤细胞，并释放大量的多种效应因子，高效地杀灭肿瘤细胞。然而，CAR-T疗法在实际应用中仍面临一些挑战，包括较长的制备周期、自体T细胞质量的不稳定性以及相对较高的治疗成本，这些因素限制了其更广泛的应用。

图3. CAR-T疗法流程图^[2]

为了突破传统CAR-T疗法的限制，UCAR-T疗法，即通用型CAR-T或异体CAR-T应运而生。这种疗法使用健康捐献者的T细胞作为原料，通过病毒载体等技术将CAR基因导入T细胞，并运用基因编辑技术去除T细胞表面的TCR、HLA或CD52等分子，以预防供体T细胞引发的移植物抗宿主病（GvHD）并降低患者对异体细胞的排异反应（HvGR）。经过这一系列精细的改造和扩增过程，UCAR-T细胞被制备成可用于治疗患者的成熟产品。

图4. UCAR-T疗法流程^[3]

UCAR-T疗法流程：

CRISPR基因编辑的体外疗法涉及从患者体内提取细胞，在实验室环境中进行基因修改，然后将经过编辑的细胞重新输回患者等过程。这种方法适用于某些关键类型的细胞，如造血干细胞（HSC），但并不适用于所有种类的细胞。另一种基因编辑疗法是直接在体内进行的基因编辑，无需细胞提取和体外操作的步骤，可直接在患者的体内进行基因编辑。这种方法易于批量生产，给药方式简单，能显著降低治疗成本，还能为难以进行细胞提取或体外培养的疾病提供治疗可能。

体内基因编辑疗法主要通过将基因编辑工具直接输送至患者体内，在体内环境中对引发疾病的特定基因进行精确且有效的修改。目前已用于体内基因编辑治疗的基因编辑工具有3类：核酸酶（Nucleases）、碱基编辑器（Base editors）及先导编辑器（Prime editors）。

图5. 体内基因编辑疗法原理图^[4]

在哺乳动物细胞中，通常利用核酸酶在基因组DNA的特定位置引入DSB实现有效的基因编辑，其中，CRISPR-Cas核酸酶系统因其高效性和精确性而成为创建定向DSB最广泛的应用工具。CRISPR-Cas核酸酶系统体内基因编辑流程如下：

图6. 核酸酶作用原理图^[1]

来源于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9蛋白是目前最为常用的一种Cas蛋白，然而，由于SpCas9潜在的脱靶效应和尺寸限制等问题，研究人员持续探索其他类型的Cas蛋白，如Cas12和Cas13，以期找到更小、更精确的Cas蛋白。同时，通过蛋白质工程技术对Cas蛋白进行改造也是当前研究的重点之一。这些改造旨在提高基因编辑的效率、减少脱靶率并优化编辑窗口，从而进一步扩展CRISPR技术在基因治疗等领域的应用潜力。

目前CRISPR基因编辑技术仍处于高速发展阶段，整个行业尚未完全成熟，随着技术的不断进步，预计会有更多的递送技术得到改进，新的传递工具也将诞生，从而进一步提高治疗的安全性和效果。体外CRISPR基因编辑疗法已上市，相信体内疗法也会在不久的将来问世。