在分子生物学研究与临床检测领域，PCR技术的高效性离不开核心工具 ——DNA聚合酶的稳定支撑。DNA聚合酶，是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。
1957 年，DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymeraseⅠ，简称polⅠ）首次在大肠杆菌中被发现，开启了DNA复制研究的新纪元；1988 年，Saiki等从耐热菌 Thermus aquaticus中分离出来的Taq DNA聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一，它实现了长时间的反应稳定性，为PCR方法的改进提供了无限可能。
Taq DNA聚合酶全长由832个氨基酸残基组成，分子量为94 kDa，包括三个主要结构域，其三维立体结构如图所示。
图1. Taq DNA聚合酶的三维立体结构
位于 N 端第 1-291 位氨基酸构成了 5’-3’核酸外切酶活性结构域，可应用于TaqMan探针的水解；第 292-423 位氨基酸构成了 3’-5’核酸外切酶结构域，但该结构域没有活性；第 424-832 位氨基酸构成了 5’-3’聚合酶活性结构域，该结构域的三维立体结构如同人的右手，可分为拇指区、手指区和手掌区。
其中拇指区负责维持DNA聚合酶与引物-模板复合物的紧密结合，进一步有助于 DNA聚合酶的延伸；手指区负责结合dNTPs；手掌区是二价金属离子结合的活性区域，负责调节结合的dNTPs与引物 3’-OH端发生反应时周围的化学环境，从而介导和催化反应的进行。
然而，在分子 POCT 等场景中广泛应用的直接PCR扩增技术，无需核酸提取步骤、操作简便快速，但面临着样本中大量抑制物影响PCR扩增的严峻挑战。如何让Taq酶在抑制物存在的情况下，依然保持高度的活性、特异性和灵敏度，成为技术突破的关键。
依托翌圣 ZymeEditor?酶改造平台，研究人员基于DNA聚合酶的结构解析与多来源酶序列比对，通过定点诱变、随机突变定向筛选、压力测试及酶蛋白片段重组等多种技术手段，对 Taq DNA聚合酶进行全方位定向改造，获得了一系列优势突变体。
接着，团队借助 MTPS 高通量筛选技术，从热稳定性、亲和力、聚合活性、外切活性等多维度筛选后，针对目前拭子直扩等终端应用场景，进一步拆解影响酶活性的关键因素，优化筛选压力，最终改造出抑制物耐受性较强的Taq酶-Hieff UNICON? Robust Hotstart Taq DNA Polymerase（Cat#14325）。
测试7个Taq酶突变体，进行不同前处理后检测外切活性，结果显示：正常超声2 min，拭子对外切活性无影响；若是震荡处理出现明显絮状物，会降低酶的外切活性。
通过长片段PCR扩增，测试水、采样拭子本身、直扩裂解液在两种条件下对聚合酶活性的影响，结果显示：拭子本身对聚合酶活性无显著影响，裂解液会抑制酶的聚合活性。
将采样后的咽拭子置于直扩裂解液中震荡处理，与TE溶液，分别作为模板稀释液，得到相同浓度的模板，同时采用14325配置的qPCR体系和市面上同类产品进行扩增，结果显示：14325体系具有更好的抑制物耐受性，支持拭子样本直接扩增。
图4. 14325及市面上同类产品拭子样本直扩性能比较
将真实血浆样本，与TE溶液，分别作为模板稀释液，得到相同浓度的模板，同时采用14325配置的qPCR体系和市面上同类产品进行扩增，结果显示：14325体系具有更好的抑制物耐受性，基本可耐受30%终浓度的血浆样本直扩。
图5. 14325及市面上同类产品血浆样本直扩性能比较
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翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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