显微课堂 | 选择科研级显微镜时需要考虑的因素

只有倒置配置，即物镜在标本下方，冷凝器在标本上方，才能提供必要的自由空间和物镜与标本的所需接近度。同时，倒置显微镜保持了对细胞的良好可及性，例如添加微操纵器。

此外，活细胞需要适当的环境才能生存。温度和 CO2 浓度必须保持在一定水平。一个气候箱及相应的控制器是完成此任务所必需的。

显微镜标本扩展到三个维度：长度、宽度和高度。虽然一些标本，如组织切片，仅在 xy 方向成像，但还有其他应用需要在 z 维度上进行采集。为了成像例如活细胞的 3D 体积，建议使用能够逐步引导样本通过焦点的电动物镜转盘。成像软件应能够重建单个图像以进行 3D 可视化。

对于活细胞，您必须添加时间维度。在这种情况下，例如系统 稳定性 是另一个关键特征。由于温度变化会影响成像系统在采集过程中的表现，因此有效的对策至关重要。自动对焦调整，例如 自适应焦点控制 (AFC)，可以抵消这些热影响，并始终找到预定义的焦点。

大多数细胞——尤其是动物细胞——在显微镜下观察时没有足够的内在对比度来看到细节。研究人员使用 对比方法 来解决这个问题。虽然相位对比 (PH) 和差分干涉对比 (DIC) 操控通过标本的光线以增加对比度，但您也可以用荧光染料 （如何准备您的标本以进行免疫荧光显微镜观察）进行染色，或者使用荧光蛋白。

根据对比方法，显微镜需要特定的设备；例如，相位对比需要特殊的物镜，而 DIC 则利用某些 棱镜，这些棱镜必须切换到光路中。对于荧光显微镜，您需要特殊的滤光块，以允许正确的光波长进入和离开标本。

如果你想拍摄你的标本或进行活细胞成像，你需要一个数字显微镜相机。特别是在荧光活细胞成像的情况下，建议使用灵敏的相机，以最小化可能对细胞造成伤害的激发光量。除了成熟的CCD和EMDDC相机外，如今 sCMOS 相机因其高量子效率和采集速度而受到欢迎。有关数字显微镜相机的更多信息，请阅读文章《数字相机技术简介》。

此外，较大的 视野 (FOV) 有助于更快地找到有趣的区域，并同时成像更多的细胞。现代研究显微镜在相机端口配备了 19 毫米视野，与 19 毫米 sCMOS 相机芯片完美匹配。

厚样本对显微镜观察来说是一个挑战。尤其是在宽场显微镜中，整个样本同时被照明，识别处于焦点的样本特征可能会因来自失焦区域的额外光线而显著降低。

Computational Clearing可以帮助获得不受失焦光影响的图像。该技术可以应用于单个图像平面以获得即时结果（ICC：即时Computational Clearing），或者可以与额外的去卷积步骤结合使用（SVCC：小体积Computational Clearing；LVCC：大体积Computational Clearing），以获得更好的结果。去卷积将光子信息重新分配到其来源，从而提供更好的焦平面中所需结构的对比度。这可以使用户更容易区分感兴趣的结构与背景，而不是使用传统的宽场图像。

在过去几年中，样本的照片处理变得流行。这意味着研究人员不仅观察活细胞，还借助光来操控它们。光漂白后的荧光恢复（FRAP）就是一个有助于理清动态细胞过程的例子。对于这些操控技术，通常需要额外的光源，这些光源必须集成到显微镜的光路中。

这种方法并不简单。徕卡无限端口是一种通用解决方案，可以将额外的光源耦合到显微镜的光路中，而不影响图像质量，以进行例如 FRAP、光切换、消融或光遗传学。只要有合适的适配器，研究人员甚至可以耦合他们自制的设备。

一个重要的问题是你能花多少钱。一些显微镜供应商提供适合特定应用的预定义配置。但是，如果你不需要你所支付的所有预配置组件呢？这就是为什么自由配置的组件可能比购买预定义显微镜系统更便宜。

此外，显微镜的要求可能会随着时间而变化。在这种情况下，可升级系统具有一定的优势。使用预定义和固定配置，你可能会发现自己被限制在有限的应用范围内。可升级性让你有自由随着需求的变化而成长。

考虑到这些因素，像徕卡DMi8 这样的模块化显微镜平台使研究人员能够从一个负担得起的显微镜系统开始，之后可以进行升级，以满足他的需求

显微镜用户的范围可以非常不均匀。尤其在大学，用户可能非常有经验或是完全的初学者。因此，使用由直观软件驱动的易用显微镜系统，例如徕卡应用套件 X（LAS X），有助于快速入门并迅速获取数据。例如，面向工作流程的设计、图像分析向导以及外设的无缝集成简化了您的工作。

除了宽场科研级显微镜，体视显微镜在生命科学研究实验室中也经常使用。有关更多信息，请参阅文章“选择体视显微镜时需要考虑的因素”。

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