拉曼光谱仪在评估药物对小鼠线粒体功能修复的应用

2025-01-03 17:45:14 39阅读次数

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一、研究背景

近年来，随着人们生活方式的改变和老龄化社会的到来，代谢性疾病（如2型糖尿病（T2DM））和感染性疾病（如脓毒症）的发病率逐年上升。这些疾病不仅给患者带来极大的痛苦，也给社会医疗资源带来了巨大的压力。线粒体氧化还原失衡是T2DM和感染性疾病等病理生理过程的关键环节。然而，传统的检测方法大多需要线粒体的分离纯化或依赖荧光探针，这不仅操作繁琐，还可能影响线粒体的正常功能。因此，开发一种无创、无标记、实时检测线粒体氧化还原状态的技术，对于提高患者的生活质量、降低医疗成本具有重要意义。

共振拉曼光谱（Resonance Raman Spectroscopy, RRS）作为一种先进的分子振动光谱技术，具有无创、无标记、高分辨率等优点，能够准确识别分子振动的独特指纹，为线粒体氧化还原状态的定量研究提供了新的可能。使用由提供的拉曼光谱仪和拉曼探头可实现小鼠血液、组织和纯化线粒体中的RRS的探测，成功评估了β-羟基丁酸（BHB）和Vericiguat等药物对线粒体氧化还原状态的改善效果。这一研究不仅为线粒体功能障碍相关疾病的精准治疗提供了新的思路和方法，也为共振拉曼光谱技术在医疗健康领域的广泛应用奠定了坚实的基础，极大地提高了检测的便捷性和准确性。

二、研究内容

研究方法

本实验选取T2DM的db/db小鼠作为实验组并随机分配接受BHB治疗或不治疗，同时以健康野生型小鼠为对照组。在治疗前及治疗后多个时间点采集血液、组织和线粒体样本，通过RRS分析检测与线粒体氧化还原状态相关的特征拉曼峰强度变化，并结合组织学（如H&E染色、SDH染色）和生化分析评估BHB对T2DM小鼠线粒体功能和病理状态的影响，实验设计示意图如图1所示。

图1 (a)不同治疗方案的实验设计示意图；(b)RRS检测线粒体氧化还原状态及评价BHB对糖尿病小鼠治疗效果的应用图形摘要。

关键技术原理

RRS是一种非侵入性、无需标记的检测技术，具有尖锐且清晰的谱峰，能够准确识别分子的振动特征。通过选择特定波长的激光（如532nm）激发样本的拉曼信号，并记录特征峰的强度变化，可以实现对线粒体氧化还原状态的定量评估。在本研究中，使用提供的拉曼光谱仪及拉曼探头，可用于检测和分析T2DM小鼠血液、组织及纯化线粒体的氧化还原状态变化。

三、实验数据

血液RRS光谱分析

使用532 nm激光激发小鼠血液的拉曼信号，在750 cm?1、1128 cm1和1585cm1处准确识别出特征峰，分别对应卟啉的对称振动、Cb-CH3侧自由基和甲基桥（CaCm、CaCmH键）的振动，主要涉及细胞色素（cyt）c和cyt b（表1）。利用532 nm的激发光，cyt c和cyt b可以通过这种共振增强效应选择性地增强，并通过拉曼光谱清晰地显示出来。由于血液的复杂性、个性和多样性，必须选择一个内部标准。位于998 cm1处的拉曼带对应于苯丙氨酸的呼吸模式。在这里，我们设置了998 cm1峰作为量化线粒体氧化还原状态的参考，它显示了蛋白质的稳定的构象变化，从而使光谱归一化。

表1. 特定拉曼条带的分配

T2DM病理状态下，氧化应激可以改变线粒体膜电位，影响细胞色素的水平，导致积累的氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），这反映了线粒体氧化还原功能障碍。如图2所示，通过比较不同时间点小鼠血液的RRS光谱，发现BHB治疗组小鼠的谱峰强度与对照组存在显著差异。特别是750cm1谱峰的强度变化，可以作为线粒体氧化还原状态的指标。BHB治疗组小鼠的该谱峰强度在治疗过程中明显高于未治疗组，表明线粒体氧化还原状态得到改善。

图2 小鼠血液的拉曼光谱监测BHB处理后线粒体氧化还原状态(a)BHB治疗后4周4组小鼠的血拉曼光谱（每组n=5）；(b)BHB治疗后4周4组5只小鼠的平均拉曼光谱；(c)BHB治疗4周后4组小鼠波数位移750cm1的归一化强度比较；(d)BHB治疗后6周4组小鼠的平均拉曼光谱（每组n=5）；(e)BHB治疗后6周4组小鼠拉曼位移750cm1的归一化强度比较；(f)不同时间750cm1的比较。

组织RRS光谱分析

T2DM可影响多个器官和系统，包括胰腺、心脏和骨骼肌，导致一系列并发症和后果。如图3所示，对胰腺、心脏、骨骼肌等组织的RRS光谱进行分析，发现BHB治疗组小鼠的750cm1谱峰强度同样发生显著变化。特别是在胰腺组织中，BHB治疗组小鼠的谱峰强度与未治疗组相比有明显增强，表明BHB对胰腺线粒体氧化还原状态的改善效果最为显著。

生化分析

如图3所示，通过生化分析手段（如SDH染色等）进一步验证RRS光谱的结果。发现BHB治疗组小鼠的线粒体功能得到显著改善，表现为SDH染色强度的相对增强和线粒体形态的恢复。

图3 通过RRS分析和SDH染色，改善了经BHB处理的db/db小鼠的胰腺、心肌和骨骼肌中的线粒体氧化还原状态。不同组小鼠胰腺组织、心肌组织、骨骼肌和分离线粒体的(a) RRS测量（每组=3）；(b)BHB治疗6周后4组750cm1的归一化强度比较；(c)4组骨骼肌和胰腺SDH染色的代表性图像（每组=4）。红色箭头表示胰腺β细胞。(d)计算骨骼肌和胰腺SDH染色的平均光密度。

实验通过RRS技术精确测量线粒体氧化还原中关键分子（细胞色素c）的振动光谱变化。同时，由于拉曼光谱具有特异性，其他潜在干扰物质（如血糖、血脂等）的光谱特征并不会影响我们的监测。

四、实验结论

本实验使用由提供的拉曼光谱仪，实现了对线粒体氧化还原中关键分子（细胞色素c）拉曼光谱的精确测量。通过对小鼠血液及组织的RRS光谱进行检测和分析，结合生化分析手段，本研究成功揭示了BHB在治疗T2DM中对线粒体氧化还原状态的修复效果。这些数据不仅为BHB作为潜在的治疗T2DM的药物提供了有力证据，也为深入理解线粒体功能障碍与T2DM发病机制的关系提供了新的视角。

此外，用相同的技术手段我们也评估了在脓毒症方面的应用，Vericiguat可以通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）改善败血症小鼠的线粒体氧化还原状态和心脏功能。

五、文献来源