1、成分设计抑制成纤维细胞

许多商业化专用培养基通过优化成分直接抑制成纤维细胞生长：

• 组织特异性优化：专用培养基通常针对特定上皮细胞类型（如气道、乳腺、角膜）设计，需根据来源选择。例如，肺上皮细胞专用培养基可能含 KGF（FGF7）促进上皮增殖，同时抑制成纤维细胞活化。

• 无法完全消除污染：若成纤维细胞污染严重，仅依赖培养基成分可能不足，需结合其他方法。

• 专用抑制剂：含多种生化成分，通过阻断成纤维细胞增殖信号通路（如 TGF-β/Smad）抑制其生长，同时不影响上皮细胞。

• 抗代谢药物：如 5 - 氟尿嘧啶（5-FU）或阿糖胞苷（Ara-C），可干扰成纤维细胞 DNA 合成，但需严格控制浓度以避免损伤上皮细胞。

• 精胺（Spermine）：在微摩尔浓度下选择性诱导成纤维细胞凋亡，而对上皮细胞毒性较低。

• 丝裂霉素 C（Mitomycin C）：处理饲养层细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞）可阻断其分裂，常用于共培养体系中抑制成纤维细胞过度增殖。

• Y-27632（ROCK 抑制剂）：通过抑制肌动蛋白收缩减少成纤维细胞贴壁，同时促进上皮细胞克隆形成。

1. 培养皿中加入 0.25% 胰酶作用 10-30 秒，立即终止消化，收集悬浮的成纤维细胞。

2. 剩余贴壁的上皮细胞继续培养，重复 2-3 次可显著降低污染。

• 消化后的细胞悬液接种至新培养皿，静置 30 分钟后，弃去含成纤维细胞的上清。

• 剩余未贴壁的上皮细胞转移至包被胶原蛋白或多聚赖氨酸的培养皿，促进其贴壁。

• 高细胞密度接种：上皮细胞在高密度下通过接触抑制减少成纤维细胞侵袭，同时分泌抑制性细胞因子（如 IL-1α）抑制成纤维细胞活性。

• 降低血清浓度：将血清浓度从 10% 降至 2-5%，减少促成纤维细胞生长因子，同时补充上皮细胞必需的生长因子（如 EGF、胰岛素）。

• 培养基替换：立即更换为专用培养基（如含 KGF 的肺上皮培养基），连续培养 3-5 天，每日观察。

• 差速消化：结合差速消化法（每次传代时消化 10 秒），逐步富集上皮细胞。

• 选择性试剂添加：在专用培养基中加入抑制剂，处理 2-3 周。

• 联合物理分离：每周进行 1 次差速贴壁，同时使用丝裂霉素 C 处理饲养层细胞（若共培养）。

• 定期检测：通过免疫染色（如细胞角蛋白 + 波形蛋白双染）监测纯度，确保上皮细胞比例 > 95%。

• 低血清传代：传代时使用含 2% 血清的培养基，并缩短消化时间（<30 秒）以减少成纤维细胞残留。