肿瘤转移相关蛋白在促进转移级联反应的多个阶段中起着关键作用，包括细胞脱离、迁移、侵袭、存活以及继发部位的定植。在单细胞水平定量监测这些蛋白的丰度与活性，对于阐明转移信号传导和肿瘤异质性具有深远意义，这对癌症早期诊断和精准治疗干预具有重要潜力。

组织蛋白酶B（CTSB）作为人类组织蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白酶，因其表达水平升高与乳腺癌恶性程度间的因果关系而备受关注。 CTSB由酶原转化而来，在细胞质中激活后分泌至肿瘤细胞外，可降解I型胶原等细胞外基质成分。 该蛋白酶参与骨转移级联反应，促进肿瘤细胞的侵袭性和溶骨过程。 因此，CTSB极有希望成为诊断乳腺癌骨转移的潜在生物标志物，并为靶向治疗分子抑制剂的筛选提供依据。

目前CTSB表达及活性的评估主要受限于对体液、组织、细胞裂解液或肿瘤细胞培养上清液的群体测量。 在活体单细胞内分析CTSB，为揭示细胞类型分化过程中的个体差异或评估异质性治疗反应提供了新机遇。在众多单细胞分析技术中，微/纳米电极凭借其独特的时空分辨率高、定量能力强、对活细胞干扰小且可实现实时检测等优势，在电化学分析领域备受青睐。

（A）当纳米电极穿透单个肿瘤细胞时，金簇（AuCs）通过活性胞浆组织蛋白酶B（CTSB）对锚定肽的特定位点切割作用而解离。（B）随后，由AuCs催化对苯二酚（HQ）与过氧化氢（H2O2）氧化还原反应产生的伏安信号定量减弱，胞浆CTSB丰度或活性与伏安信号衰减程度呈线性关系。（C）通过单细胞电化学传感技术监测肿瘤细胞演进过程及CTSB靶向治疗期间的CTSB丰度与活性，揭示肿瘤细胞异质性及其与CTSB的关联性。

图2. (A)纳米电极尖端逐步表面修饰过程的示意图。(B)AuCs/MCH/MB/AuNPs/AuNE尖端的扫描电镜图像。(C)AuNE、AuNPs/AuNE和AuCs/MCH/MB/AuNPs/AuNE的共聚焦激光扫描显微镜图像。(D)MCH/MB/AuNPs/AuNE和AuCs/MCH/MB/AuNPs/AuNE的共聚焦拉曼光谱。(E)AuNE、AuNPs/AuNE、MCH/MB/AuNPs/AuNE和AuCs/MCH/MB/AuNPs/AuNE在含1.0 mM FcCH2OH的0.1 M pH 7.4 PBS溶液中的循环伏安曲线。扫描速率：100 mV s1。(F)AuNE、AuNPs/AuNE、MCH/MB/AuNPs/AuNE和AuCs/MCH/MB/AuNPs/AuNE在含100 mM HQ和100 mM H2O2的0.1 M pH 7.4 PBS溶液中的差分脉冲伏安测量。脉冲幅度和脉冲宽度分别为25 mV和50 ms。(G)有/无电沉积AuNPs的AuC修饰纳米电极的差分脉冲伏安响应。

图4：（A）两种恶性程度不同乳腺癌细胞的胞浆活性CTSB表达水平Western blot半定量分析。（B）标准CTSB蛋白浓度梯度（第一泳道）与等细胞数量的MCF-7（第二泳道）、MDA-MB-231（第三泳道）细胞裂解物的ELISA结果光学图像。（C）两种乳腺癌细胞的Transwell显微镜图像。（D）培养在预淬灭FITC-胶原蛋白I基质上的两种乳腺癌细胞（细胞核蓝色染色）三维重构共聚焦荧光显微图像，比例尺为100 μm。（E）Western blot免疫检测中胞浆活性CTSB条带灰度值统计（均值±标准差，n=3）。（F）ELISA测定的两种细胞单细胞CTSB平均表达量（均值±标准差，n=3）。（G）通过迁移细胞计数评估的两种细胞侵袭能力统计值（均值±标准差，n=3）。（H）通过量化胶原蛋白I基质荧光强度测得的两种细胞相对胶原降解活性（均值±标准差，n=3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

单活细胞内CTSB丰度的电化学检测：

在本研究中，研究者系统评估了单个活细胞内胞质组织蛋白酶B（CTSB）的表达水平。图5C展示了单个MCF-7和MDA-MB-231细胞内典型的差分脉冲伏安（DPV）峰值电流衰减曲线。通过将纳米电极尖端插入每组随机选取的15个肿瘤细胞，研究者绘制了酶解后的DPV曲线。计算得出单个MCF-7和MDA-MB-231细胞内CTSB的平均表达水平。

图5. (A)经不同浓度标准CTSB酶解后，修饰纳米电极在含100 mM HQ和100 mM H2O2的0.1 M pH 7.4 PBS中的差分脉冲伏安响应。(B)以(II0)/I0对lgCCTSB作图建立的校准曲线，用于单细胞水平CTSB丰度定量。(C)单个MCF-7或MDA-MB-231细胞中纳米电极酶解前后的典型DPV响应。(D)15个独立MCF-7和MDA-MB-231细胞中纳米电极酶解后的DPV峰电流响应。(E)单个体乳腺癌细胞内CTSB平均丰度的计算结果。(F)通过DPV相关单细胞电化学检测与ELISA法测得的乳腺癌单细胞CTSB平均丰度对比分析。**P < 0.01，***P < 0.001。

作为CTSB特异性抑制剂，CA-074通过降低酶活性有效抑制了乳腺癌细胞对细胞外基质的侵袭与骨转移（图6J）。本研究构建的单细胞电化学传感器有望在骨转移靶向治疗中监测单个乳腺癌细胞内的CTSB活性。为此，我们追踪了经小分子抑制剂干预的乳腺癌细胞中CTSB酶活性变化。用5μM和15μM CA-074处理MDA-MB-231细胞后，随机选取15个肿瘤细胞记录其差分脉冲伏安曲线与峰值电流（图S18与图6K）。鉴于CA-074不会下调内源性CTSB表达（图6A,B），处理组DPV峰电流的降低明确源自CTSB酶活性下降。以对照组CTSB蛋白水解活性为100%基准，5μM和15μM CA-074处理后的单细胞平均CTSB活性分别为51.3±9.0%与26.0±4.8%（图6L）。该结果与群体细胞（至少3.0×10^5裂解细胞）荧光分析法测得的数据相符——相较于对照组，5μM和15μM CA-074处理后的平均CTSB蛋白水解活性分别为47.7±1.9%与29.5±1.2%（图6G）。单细胞电化学检测不仅验证了CA-074的选择性分子治疗抑制效率，更为评估细胞间异质性治疗反应提供了新工具。值得关注的是，该技术可进一步拓展至循环肿瘤细胞（CTCs）等稀有循环细胞的检测。为未来个性化转移风险评估带来重大前景。

单个活细胞内CTSB蛋白水解活性的电化学检测：

图6. (A)不同浓度CA-074处理的MDA-MB-231细胞胞浆CTSB表达的Western印迹半定量分析。(B)ELISA检测暴露于不同浓度CA-074的MDA-MB-231细胞中CTSB平均表达水平（均值±标准差，n=3）。n.s.表示无统计学意义。(C)梯度浓度CA-074处理后MDA-MB-231细胞裂解物中酶切底物Z-RR-AMC的荧光增强情况。(D)5μM和15μM CA-074处理24小时后MDA-MB-231细胞的Transwell显微镜图像（与未处理对照组对比）。(E)生长于预淬灭FITC-胶原蛋白I基质上的MDA-MB-231细胞（核蓝染）的三维重建共聚焦荧光显微图像，分别经0、5和15μM CA-074处理24小时。比例尺：100μm。(F)Western印迹免疫检测中CTSB条带灰度值统计（均值±标准差，n=3）。(G)不同浓度CA-074处理的MDA-MB-231细胞相对CTSB酶活性（均值±标准差，n=3）。(H)5和15μM CA-074处理24小时的MDA-MB-231细胞侵袭潜能统计值（均值±标准差，n=3）。(I)暴露于5和15μM CA-074 24小时后MDA-MB-231细胞的相对胶原蛋白I降解活性（均值±标准差，n=3）。(J)CA-074处理抑制乳腺癌细胞CTSB蛋白水解活性的示意图。(K)经5和15μM CA-074处理的15个MDA-MB-231细胞内酶解反应后纳米电极差分脉冲伏安峰值电流响应的统计学比较。(L)5和15μM CA-074处理前后15个MDA-MB-231细胞CTSB蛋白水解活性的单细胞电化学分析均值。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

结论：

开发了一种单细胞电化学传感器，能够准确评估电化学非活性蛋白CTSB的丰度与活性。该传感器首先通过电沉积法在纳米电极上构建分级结构的金纳米颗粒（AuNPs），随后共价连接原子级精确的肽段-金簇（AuCs）。具体而言，金纳米颗粒的电沉积显著增加了电极表面粗糙度，从而为富集更多兼具氧化还原介质和电子导体功能的金簇提供了更大表面积。这一设计增强了传感器的电催化性能，使其具备更优异的检测灵敏度。传感器的高选择性源于CTSB特异性酶切使肽段-金簇从纳米电极尖端解离，导致伏安信号降低。由此实现了对单个活体乳腺癌细胞内CTSB蛋白含量及酶活性的定量检测，这是传统群体测量无法获得的信息。研究结果表明，癌细胞中单细胞水平的CTSB丰度与活性存在固有异质性，且与细胞转移能力高度相关。未来，该传感器将把单细胞CTSB特征谱与乳腺癌患者预后、复发率及治疗响应相关联，作为预后或预测性生物标志物工具具有重要潜力。