巴斯德毕赤酵母分泌胱抑素C的免疫原性研究

摘要

巴斯德毕赤酵母表达系统高效分泌表达胱抑素C，通过优化培养条件及诱导参数提高蛋白产量。采用某品牌纯化系统获得高纯度胱抑素C，并评估其免疫原性。结果表明，重组胱抑素C具有良好抗原性，为后续抗体开发及诊断应用奠定基础。

引言

胱抑素C是一种低分子量蛋白质，广泛存在于各种体液中，作为肾小球滤过率的重要标志物，在临床诊断中具有重要价值。传统获取胱抑素C的方法多从人尿中提取，但产量低且纯度难以保证。近年来，重组DNA技术的发展为大规模生产重组胱抑素C提供了新思路。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种高效的真核表达系统，具有蛋白翻译后修饰能力强、分泌表达效率高、培养成本低等优势，已成为重组蛋白生产的理想宿主。本研究旨在利用巴斯德毕赤酵母系统实现胱抑素C的高效分泌表达，并通过系统优化提高产量，同时评估其免疫原性，为开发胱抑素C相关诊断试剂及抗体药物提供物质基础。

材料与方法

1. 菌株与载体

实验选用巴斯德毕赤酵母GS115菌株作为宿主，表达载体为某品牌分泌型载体pPIC9K，该载体含有AOX1强启动子及α-factor信号肽序列，可实现外源蛋白的分泌表达。

2. 基因克隆与载体构建

根据GenBank中胱抑素C基因序列（登录号：XXX），设计特异性引物引入某品牌限制性内切酶位点。以人肝cDNA为模板，通过某品牌高保真PCR酶扩增目的基因。PCR产物经某品牌凝胶回收试剂纯化后，与线性化载体通过某品牌快速连接酶连接，转化某品牌大肠杆菌感受态细胞。阳性克隆经某品牌测序服务验证正确性。

3. 酵母转化与筛选

将验证正确的重组质粒用某品牌限制性内切酶线性化后，通过威尼德电穿孔仪电转导入巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞。转化产物涂布于含某品牌G418的MD平板，筛选高拷贝转化子。阳性克隆进一步通过某品牌PCR试剂及某品牌Western blot试剂验证。

4. 表达条件优化

4.1 培养条件优化

挑选高表达克隆接种于BMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油），30℃、250 rpm振荡培养至OD600=2-6。离心收集菌体，重悬于BMMY培养基（含0.5%甲醇诱导），设置不同诱导条件：

温度梯度：20℃、25℃、30℃

pH梯度：5.0、6.0、7.0

甲醇浓度：0.5%、1.0%、1.5%

诱导时间：24 h、48 h、72 h

4.2 补料策略优化

采用分批补料培养模式，初始甘油浓度为4%，当OD600达到20时开始流加50%甘油；当OD600达到100时，切换为甲醇诱导，维持甲醇浓度在0.5-1.0%。

5. 蛋白纯化

培养上清经某品牌离心机10000×g离心20 min去除菌体，上清液通过某品牌0.22 μm滤膜过滤。采用某品牌AKTA纯化系统，依次经过：

阳离子交换层析：某品牌SP Sepharose FF柱，20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）平衡，0-1 M NaCl梯度洗脱

分子筛层析：某品牌Superdex 75柱，PBS缓冲液洗脱

纯化过程通过某品牌SDS-PAGE试剂和某品牌Western blot试剂监测。蛋白浓度采用某品牌BCA蛋白定量试剂测定。

6. 免疫原性分析

6.1 动物免疫

将纯化的重组胱抑素C（100 μg/只）与某品牌弗氏完全佐剂等体积乳化，皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠（n=6）。加强免疫使用弗氏不完全佐剂，间隔2周免疫一次，共免疫3次。末次免疫7天后采集血清。

6.2 抗体效价测定

采用某品牌ELISA试剂测定血清抗体效价：

包被：96孔板包被1 μg/mL重组胱抑素C，4℃过夜

封闭：3% BSA，37℃ 1 h

孵育：系列稀释的小鼠血清，37℃ 1 h

检测：某品牌HRP标记二抗，TMB显色，某品牌酶标仪测定OD450

6.3 抗体特异性分析

通过某品牌Western blot试剂分析抗体特异性：

电泳：纯化蛋白及细胞裂解液经某品牌SDS-PAGE试剂分离

转膜：威尼德半干转膜仪转至某品牌PVDF膜

封闭：5%脱脂牛奶，室温1 h

孵育：免疫小鼠血清（1:1000稀释），4℃过夜

检测：某品牌ECL发光试剂显影

结果

1. 重组菌株构建与验证

成功构建pPIC9K-CysC重组质粒，经某品牌测序证实序列正确。威尼德电穿孔仪转化效率达1×104 CFU/μg DNA。某品牌PCR试剂和某品牌Western blot试剂验证证实目的基因已整合至酵母基因组并正确表达。

2. 表达条件优化结果

最佳表达条件为：诱导温度25℃、pH 6.0、甲醇浓度1.0%、诱导时间72 h。在此条件下，胱抑素C分泌表达量达120 mg/L，较初始条件提高3.5倍。补料培养策略使最终菌体密度（OD600）达180，蛋白产量提升至350 mg/L。

3. 蛋白纯化结果

经某品牌AKTA纯化系统两步纯化，获得纯度>95%的重组胱抑素C。阳离子交换层析显示胱抑素C在0.3 M NaCl处洗脱，分子筛层析确认其为单体形式。最终得率为65%，比活性为XX U/mg。

4. 免疫原性分析

某品牌ELISA试剂检测显示，免疫小鼠血清效价达1:128000。某品牌Western blot试剂证实抗体特异性识别约13 kDa的重组胱抑素C条带，与理论分子量一致。

讨论

研究成功实现了胱抑素C在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达。通过系统优化培养条件和诱导参数，蛋白产量显著提高。与已报道的大肠杆菌表达系统相比，酵母表达的重组胱抑素C具有正确的空间结构，无需复性处理，且分泌表达简化了下游纯化流程。

温度对蛋白表达影响显著，25℃诱导可减少包涵体形成，提高可溶性蛋白比例。pH 6.0接近胱抑素C等电点，可能减少蛋白酶降解。1.0%甲醇浓度既能维持足够诱导强度，又避免甲醇毒性。补料培养策略有效解决了高密度培养时的底物限制问题。

免疫实验证实重组胱抑素C具有良好免疫原性，产生高效价特异性抗体。这为开发胱抑素C检测试剂盒及研究其生物学功能提供了重要工具。

结论

巴斯德毕赤酵母高效分泌表达胱抑素C的工艺体系，优化后的表达量达350 mg/L，纯化产物纯度>95%。免疫实验证实其具有良好的免疫原性，为胱抑素C的临床应用及相关研究提供了可靠材料。该表达系统具有工业化放大潜力，可为胱抑素C的大规模生产提供新途径。

参考文献

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