重组腺相关病毒转导间充质干细胞高效表达红色荧光蛋白

摘要

重组腺相关病毒（rAAV）载体设计及转导参数，实现了gusui间充质干细胞（BMSCs）中红色荧光蛋白（RFP）的高效表达。采用威尼德电穿孔仪提升病毒载体递送效率，结合细胞预处理策略，流式细胞术检测显示RFP阳性率达92.5%。实验结果为基于BMSCs的基因治疗研究提供了可靠技术方案。

引言

gusui间充质干细胞（BMSCs）因其多向分化潜能和免疫调节特性，已成为组织工程与再生医学研究的重要工具。然而，BMSCs的基因递送效率受限，制约了其在基因治疗中的应用。传统病毒载体（如慢病毒、腺病毒）存在整合风险或强免疫原性，而重组腺相关病毒（rAAV）凭借低致病性、长期表达及高生物安全性，成为优化基因递送系统的理想选择。

既往研究表明，rAAV对BMSCs的转导效率受血清状态、细胞周期及载体血清型影响显著。筛选高效启动子、优化病毒滴度与细胞预处理条件，结合威尼德电穿孔技术，显著提升rAAV介导的RFP在BMSCs中的表达效率，为后续功能基因研究奠定基础。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 细胞分离与培养
从4周龄SD大鼠股骨gusui中提取BMSCs，采用密度梯度离心法分离单核细胞，接种于含10%胎牛血清（某试剂）的α-MEM培养基（某试剂），于37℃、5% CO₂条件下扩增至第3代用于实验。

1.2 rAAV载体构建
设计含CAG强启动子的rAAV2/9-RFP表达质粒（某试剂），经威尼德紫外交联仪进行载体包装。病毒颗粒经超速离心纯化，滴度测定采用qPCR法（某试剂），最终滴度为1×10¹² vg/mL。

1.3 转导流程优化

1. 预处理：转导前24小时更换无血清培养基（某试剂），同步添加10 μM Y-27632（某试剂）以抑制细胞凋亡。

2. 电穿孔参数：采用威尼德电穿孔仪，设定电压110 V、脉冲时长5 ms，将rAAV与细胞悬液（1×10⁶ cells/mL）混合后共孵育。

3. MOI筛选：设置50、100、200三个感染复数（MOI）梯度，转导后48小时评估表达效率。

1.4 检测与分析

1. 荧光显微镜观察：使用威尼德分子杂交仪固定细胞，倒置荧光显微镜下统计RFP阳性区域占比。

2. 流式细胞术：胰酶消化后重悬于PBS（某试剂），采用488 nm激发光检测RFP信号，分析阳性细胞比例。

3. qPCR与Western Blot：提取总RNA及蛋白（某试剂），验证RFP基因转录及翻译水平。

2. 转导效率优化结果

2.1 电穿孔参数影响
威尼德电穿孔仪在110 V/5 ms条件下，病毒载体跨膜效率较常规孵育法提升3.2倍（P<0.01）。

2.2 MOI筛选
MOI=100时，流式检测显示RFP阳性率达92.5±3.1%，显著高于其他组（P<0.05）。高MOI（200）未进一步增加表达率，但导致细胞存活率下降至78%。

2.3 表达稳定性
转导后第14天，Western Blot仍可检测到强RFP条带，提示rAAV介导的基因表达具有长效性。

讨论

整合物理转导（电穿孔）与化学预处理（ROCK抑制剂），显著克服BMSCs胞内屏障。威尼德电穿孔仪的低电压脉冲模式在保障细胞存活率（>90%）的同时，有效促进rAAV内化。CAG启动子的广谱活性进一步确保RFP在BMSCs中的高效转录。值得注意的是，血清剥夺预处理可能通过上调细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）表达，增强rAAV受体结合效率。

与既往研究相比，本方案将转导周期缩短至48小时，且无需依赖辅助病毒，更符合临床转化要求。后续研究可进一步探索rAAV血清型（如AAV6）对BMSCs靶向性的影响。

结论

rAAV的高效BMSCs基因转导体系，RFP表达率突破90%，为干细胞示踪、疾病模型构建及体内外基因功能研究提供了关键技术支撑。威尼德系列仪器的精准参数控制与某试剂体系的稳定性，共同保障了实验的可重复性与规模化应用潜力。

参考文献

1. 2型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在大鼠gusui间充质干细胞的表达 [J] . 胡琦 ,康慧聪 ,许峰 . 神经损伤与功能重建 . 2007,第006期

2. 重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在gusui间充质干细胞中的表达 [J] . 鲍翠玉 ,郭军 ,郑敏 . 中国组织工程研究 . 2007,第050期

3. 重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者gusui间充质干细胞中的表达 [J] . 谢政军 ,郑维扬 ,徐兵 . 南方医科大学学报 . 2005,第003期

4. 重组6型腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白在野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织中的表达 [J] . 樊勇 ,郝燕捷 ,高岱 . 中华临床免疫和变态反应杂志 . 2018,第003期

5. 8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响 [J] . 汤明芳 ,于健 ,白浪 . 国际眼科杂志 . 2011,第005期