疏水层析是一种根据样品间的疏水性质差异进行分离的技术。在保证样品活性和溶解性的前提下，通常采用高盐结合、低盐洗脱的条件，达到目标分子及杂质分离的目的。常规操作大家已经非常熟悉，此篇主要分享一点大家日常容易忽略但是重要的Tips。
Cytiva疏水层析填料产品介绍
基于琼脂糖骨架和Phenyl、Butyl、Octyl和Butyl-S四种常用配基，按疏水性强弱分布，Cytiva疏水层析填料产品如下：
图1：基于核糖核酸酶A，溶菌酶和α-糜蛋白酶在填料上的保留时间，得到填料的疏水性强弱对比。该顺序可随层析条件和分子不同而变化
疏水层析影响因素
填料疏水性能和缓冲液盐种类：不同盐类型、盐浓度和pH不仅影响蛋白溶解度和稳定性，也影响填料分辨率。常用的盐种类包括(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl、 KCl、 CH3COONH4。
图2：不同盐类型对选择性的影响
所用层析柱柱为Hitrap Butyl FF(1 ml)；以图A为例，洗脱顺序依次为细胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，α-糜蛋白酶原
缓冲液pH：pH对疏水层析影响较小，HIC的分辨率和选择性通常在pH5.0至8.5之间相对稳定。大多情况下可直接选择磷酸盐缓冲液，推荐浓度20至50 mM。
添加剂：添加剂可以通过改善蛋白质溶解度、改变蛋白质构象和促进结合物的洗脱来影响蛋白质分离，从而提高选择性和分辨率。常用醇（如乙醇、异丙醇、甘油）、表面活性剂（如TritornX-100）和离液盐（如尿素）。
操作温度：操作环境及样品的温度不仅影响层析结果，同时影响样品和缓冲液的温度及粘度，在纯化过程中尽量保持温度恒定。
图3：低温条件导致样品流穿增加
疏水层析的这些小Tips
你都知道么？
过往推送中，对疏水层析在抗体、ADC、疫苗等层析工艺的应用有诸多描述，可参考如下链接：
快问快答 | 疏水相互作用篇；
细数不同偶联代次ADC药物纯化工艺；
疏水层析，让质粒纯化更简单高效；
最新发布！《双特异性抗体工艺解决方案》
下面分享几个不常见案例，希望可以帮大家打开疏水层析实验思路。
双盐层析体系提高HIC载量
疏水层析条件常见为高盐结合低盐流穿。传统采用一种盐进行层析时，常见载量一般为20-30 g/L。专利US07781395B2中，采用双盐体系，疏水层析填料载量明显提高。其原理可能为：①通过盐提高蛋白的溶解性；②通过盐促进蛋白与填料的结合。
表1：柠檬酸盐和磷酸盐
单独或共同使用对层析填料载量的影响【2】
疏水层析在内毒素去除方面的作用
疏水作用层析需要用高盐平衡柱子及上样。内毒素在高盐下易聚集，大部分不结合疏水层析填料，可在上样过程中直接流穿去除。 徐向荣等在文献《层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素》中描述了Source 15ISO在结合洗脱模式下对内毒素的去除作用，可将内毒素含量从层析前10547 EU/mg降低至层析后597 EU/mg。
流穿模式同样对内毒素有去除作用。Mark. J等利用Phenyl HP对L2-E6-E7融合蛋白进行层析，能去除3.2 log内毒素。
表2：在硫酸铵和胍盐存在下
使用Phenyl HP三批生产的平均数据【4】
*Equilibration: 100 mM PB, 20 mM Cys, 4 M GuHCl，0.7 M (NH4)2SO4，pH7.0
疏水层析在HCP去除中的作用
伴随着层析过程中样品纯度的提高，疏水层析对HCP也有着不错的去除作用。T. Hall等报道了在洗脱液中添加乙二醇和精氨酸，可以提高Phenyl HP和Capto Phenyl ImpRes的HCP去除效果。
表3：Phenyl HP和Capto Phenyl ImpRes的
HCP去除效果和样品收率【5】
*Equilibration: 20 mM Tris-0.4 M Na2SO4 , pH8.0
Loading : mAb(Protein A pool), 10-18 g/L, SEC Purity 92.8%
Wash: 20 mM Tris-0.4 M Na2SO4 , pH8.0
Elution 1(Control): 20 mM Tris-0.4 M Na2SO4(0.4-0 M) , pH8.0, 10 CV
Elution 2(Gradient):20 mM Tris-0.4 M Na2SO4(0.4-0 M)-Hexylene glycol(0-5%) / Arginine(0-1 M), pH8.0, 10 CV
Elution 3(Just Phenyl HP): 20 mM Tris- 5% Hexylene glycol/ 1 M Arginine , pH8.0, 10 CV
疏水层析在病毒去除方面的作用
HIC同样对病毒有去除作用，上样浓度、pH、线速度和电导率均会对病毒的清除有很大的影响。Matthew等利用PR772作为噬菌体病毒模型进行病毒去除效果测试，结果表明，随着盐浓度提高，Capto Phenyl 对PR772有较好的清除效果。同时，病毒清除效果随pH升高明显降低。
图4：不同pH条件下，Capto Phenyl对PR772的去除效果【6】
填料疏水能力是由骨架、配基、间隔臂共同决定的。尤其配基密度作为疏水工艺过程中关键物料属性，推荐使用Process Characterization Kit对填料变异性进行研究，保证工艺稳健性。
具体参考PC Kit助力工艺表征研究。
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