高速显微镜以前所未有的速度扫描微量滴定板

（论文部分内容摘抄）

在几乎所有的细胞培养应用中，定期控制细胞生长和细胞状态是至关重要的。由于细胞的微小尺寸，形态学评估必须借助显微镜。使几乎透明的细胞可见的一种非常普遍和广泛的技术是相差显微镜。细胞通常在营养培养基中培养在透明塑料材料例如微量滴定板(MTP)上。这样的板具有约128mm*85mm包含几个孔，这是独立的隔室细胞生长。显微分析直接在倒置显微镜上的这些微量滴定板中进行。

为了更好地了解细胞培养状态，对微量滴度板整个孔的整个内容物进行成像是有帮助的。这一点尤其正确，因为细胞集落往往更好地在井的边缘区域生长。通常需要成像的不仅仅是CTP上的一个孔，而是整个板。由于孔彼此紧密相邻，因此孔底部区域几乎覆盖了整个板的足迹。因此，在显微镜下检查完全填充的微量滴度板意味着成像面积约1万平方毫米。由于显微镜的视场很小，根据放大倍数和相机芯片尺寸的不同，其尺寸可小于或最大为几平方毫米，因此需要成千上万个单个采集器才能完成如此大的物体。当使用10倍物镜和2/3的标准尺寸相机芯片时需要近19,000张单独的图像。随后将单个图像拼接在一起，形成具有微观分辨率的单个井的分类概览图像。

在微观上获得大面积的问题是所需的时间通常很长。在基于实验室的细胞培养工作中，这可能是耐受性在大规模生产过程中，这是一个严重的问题。当每天必须对数以百计的微滴度板进行扫描，以便在自动化设备中进行工艺和质量控制时，高通量的微滴度显微镜是不可或缺的。

技术现状：

所需的扫描时间主要受图像数量和每幅图像采集时间的影响。增加视场只能略微减少图像数量。用更大的摄像头传感器。然而，这实际上仅限于4/3“因为大多数显微镜的光学器件不能使超过该尺寸的传感器不发光。

获取时间主要受定位时间的限制，定位时间比传感器的实际曝光时间长得多。现代全自动显微镜使用电动载物台，在成像之前对物体进行定位。然后，工作台移动到下一个位置，并在拍摄下一个图像之前再次停止。这个过程在整个中期计划中重复了几千次。为了应付不确定的位置，分开的位置是通常偏移小于视野的尺寸混合算法随后使用该重叠将这些图块与精确的缝合结果相匹配。这进一步增加了所需的图像数量。但主要的挑战仍然是定位时间，这是成千上万单收购的总时间。因此，短的定位时间对于微板的快速扫描是必要的。虽然阶段的加速、减速和速度可以调节到一定程度，但是由于液体培养基在突然移动时会发生抖动，这些参数的提高受到了限制。介质的抖动会引起水柱高度的变化，从而减弱传送到传感器的光线。这严重地降低了缝合图像的图像质量，因为单块瓷砖以不同的亮度出现，使得整个图像非常不协调和硬。用自动图像处理方法处理。这就是为什么平滑的加速值和等待时间在单个图像之间当使用先进的显微镜进行MTP扫描时，捕获器是必不可少的。可实现的帧速率实际上被限制在1-2fps。因此，即使在常规显微镜上以相对较小的4倍放大率成像整个微滴板也需要长达20分钟的时间。显而易见，先进的显微镜无法提供自动化细胞培养检查所需的吞吐量。

焦点测量与调整：

清晰获取的先决条件是在观察过程中物体位于焦平面内。虽然粘附细胞——顾名思义，粘附在微滴定板的透明底部，但它们并不位于一个完全均匀的平面上。注塑成型工艺对板底的几何变形约为200微米这远远超过了显微镜物镜所能承受的景深。因此，板到透镜的距离有在扫描过程中不断修正。一个很常见的方法来确定正确的工作距离是根据特定的标准(即清晰度)比较在不同距离拍摄的多个图像。这种基于图像处理的自聚焦过程不仅耗时长，而且要求被测物体在测量过程中不能移动。这就是为什么只有少数位置是用这种方法测量的，而整个焦点图是用插值计算的。目前一种基于硬件的聚焦测量方法正在开发中，它将允许实时测量每个聚焦位置，即使是在舞台运动中。在对焦点进行测量之后，利用具有300微米运动范围的同步压电z级实现对焦点位置的调整。

下一步，高速采集方法将扩展到荧光显微镜。如果成功的话，这种广泛使用的显微技术也将受益于速度的显著提高。

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