透明质酸（Hyaluronic acid，HA），是以N-已酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）和葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）二糖为基本单位形成的线性黏多糖，两种单糖之间通过β-1，3-糖苷键相连，双糖单位通过β-1，4-糖苷键相连（图1）[1]。
图1：透明质酸一级结构
透明质酸的分子量范围较广，从低分子量（<60 kDa）到高分子量（>2000 kDa），不同分子量的透明质酸具有不同的理化性质和生物功能，低分子量透明质酸具有抗炎作用，而高分子量透明质酸则具有良好的抗氧化性和润滑关节的功能（表1）[2] 。
表1：不同分子量透明质酸（HA）应用场景[3]
透明质酸的获取方式包括：
1
微生物发酵法：利用链球菌等微生物发酵生产;
2
组织提取法：从动物组织（如鸡冠、牛眼玻璃体）中提取;
3
重组表达法：通过酶法或化学合成制备（表2）。
表2：不同方法获取透明质酸特性比较[4]
不同来源获得透明质酸需要进一步纯化处理才能满足国内外药典对透明质酸质量标准的要求（表3），本文主要介绍透明质酸下游常见纯化方法，以此为合理选择透明质酸的纯化方法提供参考依据。
表3：国内外药典对透明质酸主要质量参数要求标准
01
沉淀法是透明质酸纯化中最常用的方法之一，主要包括季铵盐沉淀法和有机溶剂沉淀法。
季铵盐纯化法
是利用季铵盐与透明质酸在低盐条件下形成络合物沉淀，从发酵液中不断分离出来，再通过高浓度盐溶液解离，从而获得高纯度的透明质酸产品。
常用的季铵盐有溴代十六烷基吡啶（CPB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、氯代十六烷基三甲基吡（CPC）和其它长链季铵盐[5] ，该方法提纯的HA纯度较高，效果较好，能除去样品中不和季铵盐络合的杂质。
有机溶剂沉淀法
是通过影响介质的介电常数造成分子聚集来去除蛋白质。黄小红等采用乙醇和季铵盐相结合的方法以微生物发酵液为原料提取纯化透明质酸，研究发现采用某些表面活性剂，如十六烷基吡啶（CPC）等，与透明质酸的聚阴离子形成络合物沉淀，相比于单独用乙醇沉淀透明质酸提取效率更高（表4）[6]。
表4：乙醇和乙醇与CPC结合沉淀HA的提取率的比较
02
超滤法是利用超滤膜进行过滤，使不同分子量的物质获得分离，以达到清除杂质、浓缩样液以及获得高纯度产物的目的。
张延良等使用中空纤维和超滤膜包利用超滤方法得到低分子量透明质酸溶液的蛋白去除率达到97%以上，透明质酸收率为83.5%[7]。
作者比较不同孔径超滤产品纯化透明质酸的蛋白去除率和收率，结果发现截留分子量为10 kDa的超滤膜比较合适（表5）。
表5：不同截留孔径膜包对透明质酸收率及蛋白去除率的影响
研究人员进一步比较了乙醇沉淀法和超滤法获得透明质酸的质量参数和生产成本，发现乙醇沉淀法与超滤法比较，两种工艺的收率相近，但超滤工艺的蛋白去除效果较好。
从生产成本来看，超滤设备的投资和乙醇工艺的成本相比，2年即就可抵消设备成本，因此长期来看超滤法具有更低的生产成本（表6）[7]。
同时研究人员通过实验发现在透明质酸纯化过程中，使用中空纤维或者超滤膜包效果没有差异。
表6：两种工艺的质量参数和成本对比
Oueslati等使用100 KDa PES膜包纯化分子量2 MDa的透明质酸，通过10倍体积的洗滤样品透明质酸纯度从3%提高至接近100%，样品收率也接近100%[8]。
需要说明的是因为透明质酸分子量分布范围较广，选择超滤膜包或者中空纤维孔径要依据具体透明质酸和需要去除杂质的分子量进行确定。
Cytiva中空纤维产品和超滤膜包产品系列齐全——
超滤中空纤维膜和膜包包括：1 k，3 k，5 k，10 k，30 k，50 k，100 k，300 k，500 k，750 kDa NMWC（截留分子量）；
微滤中空纤维膜和膜包包括：0.1/0.2/0.45/0.65 μm（图2），产品规格可以满足从实验室到生产规模不同样品体积的需求。
图2：Cytiva中空纤维柱和超滤膜包产品
03
透明质酸纯化过程中层析色谱方法包括凝胶过滤和离子交换两种主要形式。
凝胶过滤层析也称为体积排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC），是根据物质分子量大小和形状的差异进行分离的层析技术。透明质酸分子结构中含有多个葡萄糖醛酸单元，使其在中性pH条件下带负电荷。这种负电荷特性使得透明质酸能够与带正电荷的阴离子交换填料（如DEAE）发生吸附作用。实践中通常把凝胶过滤和离子交换两种方法结合使用，以获得纯度更高的透明质酸。
Kakizaki等使用Cytiva阴离子交换填料DEAE从鲑鱼软骨中分离出透明质酸（HA），再使用Cytiva凝胶过滤填料Sepharose CL-4B进行脱盐处理[9]。研究人员使用DEAE填料通过线性洗脱方式，大约在0.2 M NaCl浓度条件下洗脱得到透明质酸（Pool X，Frs.112–132）（图3）。
图3：DEAE-Sephacel纯化透明质酸层析图谱
目前，Cytiva有新一代高流速Capto骨架离子交换填料以及高分辨率分子筛填料提供，进而帮助提高透明质酸纯化的纯度与收率。
总结
以上透明质酸纯化工艺中的方法，每种方法都有不同使用场景和特点，比如季铵盐沉淀法多用于发酵液的直接沉淀；离子交换层析法和凝胶层析法是常规的制备较高纯度透明质酸的方法；超滤法同样是透明质酸纯化工艺中的常用方法。
各种纯化方法不是独立排斥的，通常是多种方法配合使用，图4展示了重组表达透明质酸下游纯化工艺，使用到沉淀、过滤和层析等纯化方法[4]。
图4：透明质酸的纯化过程示意图[4]
除了以上纯化方法，透明质酸纯化常见方法还包括过滤法，吸附法和电泳法等，这些纯化方法各有其优缺点，实践中通常是多种纯化方法配合使用。通常需要根据具体的工艺要求和成本考虑，选择合适的纯化方法。一般过滤法和吸附法适用于初步纯化，而离子交换层析法和过滤技术则适用于进一步纯化。
通过综合应用以上各种方法，可以有效提高透明质酸的纯度和收率，满足不同应用领域纯化透明质酸的需求。
下期内容预告
作为本文后续内容，下期将给大家带来与透明质酸降解密切相关的透明质酸酶（hyaluronidase, HAase）下游纯化相关内容，敬请关注。
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