探索组学方法在食品真实性和品质研究中的潜力

蛋白质组学研究特定条件下蛋白质整体水平的存在状态及活动规律，不仅可以鉴定蛋白质种类，还可进行蛋白质定量，为分析不同物种，产地和成熟阶段的食品蛋白质组分和含量提供了新思路。基于高分辨质谱技术的蛋白质组学近几年发展迅速，一次实验可鉴定几千种蛋白质，已成为食品安全控制方面有力的研究手段。目前，蛋白质组学已在物种鉴定、产地溯源、品质研究、掺伪制假等多个领域得以应用。

近些年肉类掺假事件层出不穷，在利益的驱使下不法商家使用价格低廉的鸡肉、鸭肉、猪肉、马肉等伪造牛羊肉制品，严重侵害了消费者的权益和食品的公平交易，同时给食品安全带来极大的隐患。赛默飞液质组学应用团队采用Orbitrap? Exploris? 480超高分辨率质谱仪系统，基于数据依赖型模式（DDA）进行数据采集，结合Proteome Discoverer 3.0软件对猪、牛、羊肉样品进行非标记定量蛋白质鉴定与分析，筛选不同肉类的特征肽段并根据特征肽鉴别肉的种属以提高鉴别的准确性，为肉类掺假检测提供技术支持。表1展示了采用数据依赖型采集模式（DDA）对500ng的猪、牛、羊肉样品分别鉴定到43728、47770、51150张匹配谱图（PSM），这些谱图归属于8062、8707、9372条肽段（Peptide Groups）, 猪、牛、羊样品中分别鉴定到1430、1516、1441个蛋白（Protein Groups）。采用Orbitrap高分辨率质谱鉴定不同物种样品，极大的丰富了分析结果中的蛋白质和多肽的信息，为后续物种特异性多肽的筛选提供充足数据。

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随后通过比较分析猪、牛、羊样本中的蛋白质和肽段列表，Z终在猪肉样品中鉴定到10条特征肽，牛肉样品中鉴定到10 条特征肽，羊肉样品中鉴定到7条特征肽。这些特征肽段主要来自肌球蛋白、肌红蛋白、血红蛋白、热休克蛋白等肉类中高峰度蛋白，具有物种特异性，可用于后续肉类掺假的定性和定量分析。图1展示了以肌红蛋白为例展示其在不同物种中特征肽的母离子色谱质谱提取峰及其二级碎片离子质谱图，碎片离子的实测 m /z与理论 m /z 偏差小，谱图质量高，可用于后续定性定量分析鉴定参考。

图1 不同物种Myoglobin蛋白特征肽的色谱质谱提取峰及质谱图（点击查看大图）

为模拟真实掺假样品，将猪肉样品按不同比例掺入牛羊肉样品中，按1:1:1质量比例制备猪：牛：羊肉等比例混合样品，按1:1比例制备猪：牛混合样品，按1:1比例制备猪：羊混合样品。对于上述样品通过非标记定量蛋白组学方法进行数据采集，随后利用 Proteome Discoverer 软件对肽段的母离子峰强度进行定量，利用该方法定量分析肉类样品中蛋白质丰度的变化。

上述每个样品进行3次技术重复鉴定，随后统计Peptide Abundance的强度信息，图2A展示了每组样品Peptide信号强度分布波动小，结果有较好的稳定性和重现性；使用Proteome Discoverer软件中的Protein Marker模块对鉴定到的蛋白进行不同种属蛋白显示，以猪：牛：羊肉等比例混合样品为例（图2B），结果显示混合样品中属于猪、牛、羊种属的肽段占比分别是30.81%、33.36%以及35.83%，这与实际掺入的比例一致。将猪、牛、羊肉单独分析样品及等比例混合样品的质谱数据经 PD 软件预处理，并基于Peptide Abundance值进行主成分分析（PCA 聚类分析）。如图2C所示，每组样品的3次技术重复鉴定结果紧密的聚合在一起，纯猪、牛、羊肉样品分别在3、1、4象限，说明这三个样品在Peptide Abundance上存在明显差异，区分效果较好。同时我们也发现，按等比例混合的样品在PCA分析中也能够彼此有效的区分开，同时与纯猪、牛、羊样品区分开。

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代谢组是基因组的延伸和终端，研究的是和表型相关性Z强的生物体代谢终产物。基因组、蛋白组的变化不一定得到表达，并可能不对系统产生影响，但是小分子的产生和代谢是一系列事件的Z终结果，能够更直接、更准确的反映样品（生物体）的变化和之间的差异。代谢组学可视作通过对样品中的小分子物质群进行高信息量的化学指纹图谱表征，进而寻找差异并对其结构定性的一种研究范式，是一种研究思路与工具策略。在食品科学领域，组学思路已经较多的用于食品的安全和品质研究。

这是一篇来自台湾成功大学的研究报道，该文章基于Orbitrap高分辨质谱QE Plus研究了新鲜鱼在储存过程中小分子代谢物的变化，并尝试鉴定能够指示鱼肉新鲜度的潜在标志物。该实验分三个阶段进行：第一步将鱼肉在4℃储存72h，然后采用full scan 模式采集所有样品在m/z 70~1000的MS1信息，对数据进行对齐、归一化和过滤筛选后，得到487,924,375个有效特征峰；第二步将三批次样品中共有的115个特征峰，采用数据依赖扫描模式（TOP N=10）获得二级谱图，然后通过搜索高分辨谱库鉴定，其中有8个代谢物可视为潜在的鱼肉新鲜度标志物；第三步将新鲜鱼肉在4℃分别储存0h、24h、48h、72h，研究8个标志物随时间的变化趋势，进而验证它们对鱼肉新鲜度的指示作用。研究结果表明，在储存过程中鱼脂质的酶促水解导致游离脂肪酸亚油酸（ALA），二十二碳六烯酸（DHA），花生四烯酸（AA）和亚油酸（LA）的积累。随着有氧呼吸的停止，脂肪酸的氧化迅速从线粒体重新导向到过氧化物酶体，导致癸酰肉碱的减少。随后，ATP的产生停止，并产生大量的降解化合物（尿嘧啶，次黄嘌呤和肌苷）导致鱼肉腐败。

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除此之外还有很多学者基于Orbitrap高分辨质谱，结合专业的代谢组学软件Compound Discoverer和脂质组学软件LipidSearch, 研究了高附加值作物产地溯源、不同品牌年份白酒或葡萄酒的差异、食品发酵过程中小分子物质群变化、乳品品质和掺假等，均取得了非常好的效果和成果。总得来看，其基本分析流程和思路如下：

食品组学是近年来食品研究领域里Z受关注的研究内容之一，强调将食品作为一个整体看待，利用新兴的、综合的、高通量的检测技术整体呈现食品对人体健康调节、营养平衡等方面的贡献，从而突破传统意义上的将食品中单个成分进行单独研究从而导致研究结果与真实情况差异较大的局限性。食品组学的未来：多组学工作流整合。赛默飞可以提供全景式多维度的组学技术，帮客户实现从数据发现到多水平数据处理，再到多层信息深度挖掘。