如何使用简便的OFIC样本处理方法研究秀丽隐杆线虫里的蛋白质“秘密”？

4.21日，美国特拉华大学Yanbao Yu团队在ACS Publications发表了一种OFIC（on-filter in-cell）样品处理方法，深度分析了低样本量秀丽隐杆线虫的蛋白质组，仅从200条线虫样本中可鉴定出超过9400种蛋白质，这是目前报道出的最高蛋白质组数据。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)是一种广泛使用的遗传模型生物，但该线虫的表皮结构使得细胞内蛋白质的提取很复杂，而细胞内蛋白质提取是典型的自下而上蛋白质组学的前提条件。传统的物理破坏程序不仅耗时，而且还会导致大量样本损失，使得低样本量样本蛋白质组学分析十分困难。

本研究提出了一种在滤膜上细胞内(OFIC)的样本处理方法，该方法可在甲醇固定后的秀丽隐杆线虫细胞中直接消化线虫蛋白质。通过OFIC方法处理样本，进行单次LC-MS分析，并且无需分馏或富集样本，从仅200条线虫的样本中可鉴定出超过9400种蛋白质，这是迄今为止报道的秀丽隐杆线虫蛋白质组的最高数据。

通过将OFIC处理方法与传统的裂解方法进行比较，系统地评估了该方法的性能。数据表明，OFIC处理方法在秀丽隐杆线虫蛋白质组鉴定和定量方面具有更出色的性能。本研究还使用更低样本量的样本(包括单个线虫)对OFIC方法做了进一步评估。

图1是秀丽隐杆线虫蛋白质组快速深入分析流程图。对于OFIC处理方法，将线虫用甲醇固定后，再在E3filter上进行蛋白消化。为了进行对比，将SDS-裂解和TFA-裂解的线虫同时在E3filter上进行处理。

图1

将OFIC处理方法用于秀丽隐杆线虫蛋白质组分析并进行评估，图2中（A、B）是三种处理方法所鉴定出的蛋白质和肽段数比较；每种处理方法都进行了三次重复实验；*p<0.05，**p<0.01，*** p < 0.001。（C、D）是鉴定出的蛋白质和肽段数的CV值分析。（E）是基于肽段强度计算的消化效率。（F）是蛋白质强度的箱线图。（G）是三种方法的重复实验的皮尔逊相关性。（H）是蛋白质鉴定的维恩图。（I）是由三种方法定量的蛋白质的Heatmap。

图2

研究中还采用这种方法来确定超氧化物歧化酶sod-1(人类SOD1的同源物，该基因与肌萎缩侧索硬化症相关)的缺失如何影响蛋白质组。仅以50条幼虫的8800种蛋白质作为初始样本进行分析表明，sod-1的缺失会影应激反应、核糖体生成和代谢所需的蛋白质的丰度。总之，简便的OFIC方法(可广泛应用于其他系统)提供了迄今为止针对秀丽隐杆线虫蛋白质组学报道的最简单的工作流程的同时，最大程度减少了样本损失。

图3中（A）是实验流程图；（B）火山图展示了在sod-1突变体中丰度降低（蓝色）和增加（红色）的蛋白质；虚线表示1.5倍变化以及调整的q值为0.05；（C）通过WormCat分析确定的显著富集类别中上调和（D）下调的蛋白质数量（(p < 0.05，Fisher精确检验）；柱状图代表每个类别中的蛋白质数量，点代表p值。

图3

OFIC处理方法不仅可以大幅简化蛋白质组学样本处理过程，还能使低样本量样本实现无偏的深度蛋白质组分析。使用基于OFIC的E4tips对野生型和sod-1突变型蠕虫进行蛋白质组学比较，获得了前所未有的蛋白质组深度分析结果，表明了这种简单方法在解答具有生物学意义的问题方面的巨大潜力。以前无法用于蛋白质组学实验的基因型，包括雄性个体和平衡品系，现在都可以进行分析。

OFIC处理方法与传统的基于底物的蛋白质组学方法不同，传统方法需要大量的初始样本和较长的样本处理步骤，而这种创新的单容器方法极其便捷，它省去了细胞裂解和破坏的步骤，加载样本后无需进一步的样本转移，并且直接在细胞内消化蛋白质，大大减少了样本损失和技术差异的影响。并且，与传统的基于裂解的方法相比，OFIC处理方法不影响蛋白质和肽的鉴定数量、重现性、消化效率、多余的修饰以及定位在细胞器亚细胞区室中的蛋白质鉴定。

此外，OFIC方法的应用方式比较灵活，研究人员通过最近开发的E4系列产品（例如E4plate）实现了高通量和自动化，并用于秀丽隐杆线虫的高通量药物筛选。

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