[科研前线│Handy PEA]OJIP曲线可以作为评估植物诱抗剂诱导植物抗高温能力的高通量诊断工具

植物抗性诱导被认为是保护作物免受极端高温（HT）影响的一种有前途的策略。然而，准确评估植物抗性诱导剂（PRIs）抗高温能力的快速高通量方法尚未开发出来。叶绿素a荧光（ChlF）作为一种无损技术，已广泛应用于农学、生态学、环境和植物科学等领域，特别是ChlF诱导动力学（OJIP）曲线为早期诊断提供了快速和精确的工具，以评估不同胁迫对植物生理状态的影响。

为了量化AMHA对HT胁迫诱导的OEC损伤的影响，作者比较了O-J相间的标准化W_OJ=（F_t–F_O）/（F_J-F_O）和O-J相间的相对可变荧光标准化ΔW_OJ=W_OJ（HT）-W_{OJ（未处理）}（图1C）。40℃ HT处理的叶片ΔWOJ出现了明显的正K峰，但0.1μM和1μM AMHA有效地缓解了K峰。k峰的变化可以通过JIP-test参数W_K来量化。当活性OEC的比例越高时，K峰就越低。k峰的振幅（ΔWK=W_K（HT）-W_{K（未处理）}）在ΔW_OJ中可以清楚地观察到（图1C）。与对照组相比，AMHA导致40℃HT处理的叶片k峰分别下降31%（0.01μM）、44%（0.1μM）、71%（1μM）和27%（10μM）。与其他浓度（尤其是1μM AMHA）相比，10μM AMHA对K峰的增加影响较小。作者推断，AMHA能有效地维持OEC的完整性，保护PSII的活性免受HT的胁迫。因此，可以建立一种基于叶圆片系统和OJIP曲线的方法，以评估AMHA诱导植物抗HT胁迫的活性。

为了进一步优化评估AMHA诱导HT抗性能力的温度，作者根据JIP-test参数PI_ABS与处理温度之间的关系建立了一个模型，以沿着拟南芥叶片温度梯度对HT胁迫程度进行分类（图2）。在所有超过50个JIP-test参数中，表示PSII整体光合活性的PI_ABS是对各种胁迫最敏感的参数。它可以作为植物活力的指标，并对胁迫敏感性水平进行排序。如PI_ABS对温度反应的排序图（图2C）所示，当温度升高到42℃时，以25℃为标准的PI_ABS相对值明显随温度升高而降低。根据相对PI_ABS值的下降百分比分为四个等级：无热胁迫的常温（20.7℃≤T≤26.4℃），PI_ABS下降不超过5%（0.95≤y≤1）；温和热胁迫温度(26.4℃<T≤33.1℃），PI_ABS下降5%至25%（0.75≤y<0.95）；中等热胁迫温度（33.1℃<T≤40.2℃），PI_ABS下降25%至70%（0.30≤y<0.75）；重度热胁迫温度（T>40.2℃），PI_ABS下降70%以上（0≤y<0.3）（图2C）。因此，本研究中使用的温度能有效地根据拟南芥植物的JIP-test参数建立可靠的热敏感性模型。

为了进一步验证该模型，作者还根据参数Hs得出了不同浓度的AMHA在40℃HT下的相对刺激比（Kc）。暴露于40℃高温的拟南芥叶圆片中的相对刺激活性具有剂量依赖性的正效应（图3D）。AMHA的浓度为0.093μM，可产生相当于50%的反应（EC₅₀）。作者最近的研究表明，在实验室和田间条件下，浓度为0.01至10μM的AMHA能显著增强几种植物对HT的抗性。因此，这种基于参数Hs的方法具有评估目标化合物诱导HT抗性活性的潜力。

在本文的研究中，SA缓解了拟南芥叶片在40℃HT下OJIP曲线中K-P阶段的下降和K峰的出现，并对K峰水平表现出剂量依赖性（最高达200μM）的负面影响。不同浓度的SA明显减少了HT对PSII的OEC中心的损伤。在100μM SA的作用下，拟南芥叶片的OJIP曲线K-P阶段随温度升高而下降的趋势明显缓解，尤其是在38℃及更高的HT条件下。与对照叶片相比，SA处理叶片的K峰水平分别下降了约20%（35℃时）、63%（38℃时）、64%（40℃时）和43%（42℃时）（图4B）。这些结果与AMHA处理的叶片相似，但100μM SA保护OEC免受HT损伤的能力高于1μM AMHA（图2B）。在不同温度下，SA和AMHA对11个JIP-test参数的影响相似（表1）。与1μM AMHA相比，100μM SA的HT抗性诱导能力更强，因为SA的Ci值比AMHA高1.6℃。在0至200μM的范围内，Kc与SA的浓度呈明显的正相关（图4D）。SA的EC₅₀为63μM，远大于AMHA的EC₅₀，表明在HT胁迫下，AMHA的植物诱导能力强于SA。因此，此模型可以用来区分SA和其他PRIs诱导HT抗性能力。

图6.AMHA和SA对高温下两周龄拟南芥光合效率的影响

为了确定该方法在不同物种中的适用性，作者选择了番茄来评估AMHA在诱导HT抗性方面的活性。在40℃高温处理下，在AMHA浓度从0.01μM到1μM的增加过程中，番茄叶片K峰值水平受到剂量依赖性的负面影响。与拟南芥相似，在番茄中，10μM的AMHA活性低于1μM，但高于1μM以下的浓度。将番茄叶片置于25至40℃的不同温度下，无论用水或1μM AMHA处理，K-P相水平都会随温度的升高而降低。在40℃高温条件下，对照叶片的OJIP曲线出现了明显的K-step。然而，与对照相比，AMHA大幅提高了K-P相水平，并降低了K-step振幅（图9A）。与对照组相比，AMHA处理的叶片的K峰分别显著降低了约43%（35℃时）、32%（38℃时）和30%（40℃时）。经AMHA处理的番茄叶片与对照番茄叶片在30℃高温下的K峰值水平无明显差异（图9B）。在不同温度的番茄叶片中，11个具有代表性的JIP-test参数都有显著的温度依赖性变化。这与AMHA和SA处理的拟南芥叶片的结果不完全一致（图2A、2B、4A、4B）。

在本研究中，作者利用OJIP曲线技术量化PRIs诱导拟南芥叶片抗HT的能力。研究结果表明，AMHA主要通过减轻高温对OEC中心的损伤来维持PSII的整体活性，从而增强植物对HT胁迫的抗性。由新型JIP-test参数Hs得出的Ci和EC₅₀是评估AMHA诱导HT抗性的有效指标。EC₅₀越低，表明诱导HT抗性的能力越强。HT抗性诱导能力按Ci范围分为三类：低抗性（0℃<Ci≤1℃）、中抗性（1℃<Ci≤2℃）和高抗性（Ci>2℃）。与传统的植物存活率、叶绿素荧光成像和下胚轴伸长检测方法相比，基于Hs参数的新模型为PRI诱导HT抗性能力的量化提供了一种高效、可靠、廉价且易于使用的工具。因此，该模型有望作为一种高通量筛选方法，用于准确预测其他候选PRIs在不同植物物种中诱导HT抗性的能力。

图9 基于OJIP曲线和JIP-tes分析技术评估AMHA诱导植物HT抗性的实验流程